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第一章 引言1

一、遗传工程的概念1

二、遗传工程的发展概况2

三、遗传工程所需的微生物学原理8

（一）大肠杆菌的一般特性8

（二）抗生素抗性9

（三）细菌细胞的生长9

第二章 遗传工程的载体12

一、质粒载体12

（一）质粒的复制12

1.质粒的复制起始和控制12

2.质粒的不相容性13

（二）质粒的改造14

（三）目前常用的质粒载体14

1.带有多克隆位点的质粒15

2.带有噬菌体启动子的质粒15

3.表达质粒15

二、单链噬菌体克隆载体17

（一）M13噬菌体17

（二）α互补18

（三）M13及其寄主的改造18

（四）噬菌粒19

三、双链噬菌体克隆载体19

（一）λ噬菌体的基因组结构与侵染20

1.λ噬菌体的生活周期20

2.λ噬菌体的基因组结构20

3.λ噬菌体的侵染20

（二）λ噬菌体载体的构建22

1.生物学制约24

2.载体的通用性24

3.体外包装24

四、粘粒载体25

第三章 DNA的提取28

一、原核生物染色体DNA的提取28

二、原核生物染色体外DNA的分离28

三、质粒DNA的快速提取31

四、真核生物染色体DNA的提取31

五、DNA浓度和纯度的光学分析32

第四章 遗传工程的酶学基础34

一、限制性内切酶34

（一）寄主的限制和修饰34

（二）限制性内切酶的类别36

1.第一类限制性内切酶36

2.第二类限制性内切酶36

3.第三类限制性内切酶40

（三）限制性内切酶的纯化40

（四）限制性内切酶反应的终止41

二、DNA聚合酶41

（一）E.coli DNA聚合酶I41

（二）E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段42

（三）T4 DNA聚合酶43

（四）天然的T7 DNA聚合酶45

（五）修饰的T7 DNA聚合酶45

（六）Taq DNA聚合酶和反转录酶46

三、依赖于DNA的RNA聚合酶46

四、DNA及RNA的修饰酶47

（一）末端脱氧核苷酸转移酶47

（二）T4多核苷酸激酶47

（三）碱性磷酸酶48

五、核酸酶48

（一）DNA酶I48

（二）Bal 31核酸酶49

（三）S1核酸酶50

（四）外切核酸酶III50

（五）核糖核酸酶H51

第五章 凝胶电泳和杂交分析52

一、凝胶电泳52

（一）基本原理52

（二）DNA的可见性53

（三）电泳图谱53

（四）凝胶系统54

（五）实验条件对凝胶电泳的影响54

（六）指示染料和加样缓冲液55

（七）DNA分子大小的确定55

（八）DNA的回收56

二、杂交分析57

（一）Southern吸印和杂交分析57

（二）Northern吸印和杂交分析59

（三）Western印迹检测技术59

（四）DNA的斑点杂交59

（五）探针的制备60

1.缺口平移法60

2.随机引物法61

3.液体闪烁计数61

4.非放射性探针62

（六）DNA芯片技术63

第六章 DNA的连接67

一、大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶67

二、DNA片段在体外的连接69

（一）粘性末端的连接70

（二）平齐末端的连接70

（三）非互补末端的连接70

（四）接头的使用72

1.linker72

2.adaptor73

三、影响连接反应的因素74

四、提高连接反应效率的两项措施75

第七章 细菌转化77

一、细菌转化的原理77

二、细菌转化的方法79

（一）简便、快速的感受态制备和转化方法79

（二）标准的高效转化法80

（三）“超级感受态”细胞的制备和转化80

（四）菌落转化法80

（五）X1776的转化方法81

（六）电击转化81

三、转化的评估指标82

（一）转化效率（转化频率）82

（二）感受态细胞的比例82

第八章 理想克隆的鉴定83

一、表现型的鉴定83

（一）利用抗生素进行筛选84

（二）利用显色进行筛选84

二、限制性作图分析86

（一）限制性作图86

（二）限制性分析与Southern杂交相结合88

三、菌落和噬菌斑的原位杂交88

（一）菌落原位杂交88

（二）噬菌斑原位杂交88

（三）原位杂交的优越性和进一步的鉴定90

四、用PCR扩增目的片段90

五、免疫检测法90

（一）用免疫检测法筛选表达文库的过程91

1.筛选噬菌斑构成的表达文库91

2.筛选菌落构成的表达文库91

（二）关于免疫检测法的几个问题91

1.多克隆抗体和单克隆抗体91

2.多克隆抗体的来源92

3.第一抗体的检测92

4.第二抗体的来源92

5.对酶促发色法和放射化学法进行比较93

6.对碱性磷酸酶与抗体的偶联物和辣根过氧化物酶与抗体的偶联物进行比较93

7.诱导外源蛋白表达的时间93

六、酵母人工染色体文库的筛选93

（一）YAC基因组文库的保存94

（二）YAC基因组文库的筛选方法94

（三）构建、贮存和筛选的分工95

（四）筛选YAC文库的流程95

第九章 克隆基因在大肠杆菌细胞中的表达97

一、外源基因在大肠杆菌细胞中表达的原理和技术97

（一）表达系统的选择97

1.蛋白质的大小97

2.蛋白质的活性97

3.蛋白质的需要量97

（二）启动子的选择97

1.乳糖操纵子的启动子（lac UV5启动子）97

2.色氨酸启动子（trp启动子）98

3.乳糖操纵子和色氨酸操纵子的复合启动子（tac或trc启动子）98

4.噬菌体T7启动子98

（三）融合蛋白质的表达98

1.融合蛋白质表达的特点和载体98

2.融合蛋白质的分离99

（四）促使基因表达“天然的”蛋白质产物99

（五）提高外源蛋白质的稳定性100

二、优化外源基因在大肠杆菌中表达的原理和技术100

（一）构建最合适的启动子100

（二）使翻译起始尽可能完善101

（三）密码子的选择101

1.密码子的选择与细胞中tRNA的丰度相关101

2.在嘧啶结尾密码子中对第三位上嘧啶的非随机选择101

（四）质粒的拷贝数及其稳定性101

（五）寄主细胞的生理状态102

第十章 cDNA文库技术103

一、cDNA文库的构建104

（一）对cDNA文库的要求104

（二）mRNA的分离纯化105

（三）cDNA第一链的合成105

（四）cDNA第二链的合成106

（五）cDNA的克隆107

（六）cDNA的载体引导合成法110

（七）构建cDNA文库的载体系统111

二、cDNA文库的筛选113

（一）菌落和噬菌斑的原位杂交113

1.差示杂交筛选113

2.扣除cDNA探针114

3.合成寡聚核苷酸探针或引物114

（二）用PCR的方法筛选cDNA文库116

（三）特异配体与蛋白质相结合的方法117

（四）酵母双杂分析法117

1.工作原理118

2.做法119

第十一章 基因组文库的构建121

一、用于λ载体的外源DNA的制备123

（一）机械切割123

（二）限制性内切酶的部分消化124

二、λ载体DNA的制备126

（一）双酶消化法127

（二）λ Charon 4A载体DNA的制备128

三、连接、体外包装和侵染大肠杆菌128

四、噬菌体λ和粘粒两种载体构建的基因组文库的比较129

五、YAC、BAC、PAC文库129

（一）YAC文库129

（二）BAC文库131

（三）PAC文库132

第十二章 DNA的序列分析136

一、Maxam和Gilbert的化学测序法137

（一）方法137

（二）原理138

（三）专门用于化学测序的载体140

二、Sanger的双脱氧测序法142

（一）原理142

（二）过程142

（三）关于双脱氧测序法的若干问题142

三、双脱氧测序与M13克隆系统相结合144

四、自动化测序和热循环测序146

（一）自动化测序146

（二）热循环测序147

五、双脱氧测序法和化学测序法的比较147

六、DNA大片段的测序147

（一）随机测序法147

（二）利用嵌套式缺失体进行测序148

1.利用外切核酸酶III构建嵌套式缺失体并测序148

2.利用Bal 31核酸酶构建嵌套式缺失体并测序149

3.洪国藩的DNA系统测序策略151

（三）引物步移法152

七、基因组测序153

第十三章 聚合酶链式反应155

一、聚合酶链式反应的原理155

二、聚合酶链式反应的必要条件157

（一）引物设计157

（二）PCR的温度158

（三）PCR的反应体系159

三、聚合酶链式反应的应用160

（一）原位PCR160

（二）RT-PCR160

（三）差异显示反转录酶PCR162

（四）单侧PCR164

1.3′RACE164

2.5′RACE164

（五）反向PCR166

（六）鉴定甲基化的PCR167

第十四章 克隆化DNA的定点诱变169

一、盒式诱变169

二、寡核苷酸介导的诱变172

（一）Kunkel定点诱变法172

（二）硫代核苷酸负链诱变法173

三、PCR诱变174

（一）重叠延伸诱变法174

（二）大引物诱变法176

（三）掺入诱变引物的PCR扩增179

（四）基于PCR的诱变鉴定180

第十五章 图位克隆法184

一、遗传连锁图184

（一）DNA分子标记185

1.RFLP185

2.RAPD188

3.AFLP189

4.SSR191

5.STS192

（二）植物遗传图谱的构建194

1.亲本的选择和作图群体的建立194

2.作图程序195

（三）近等基因系和集团分离分析196

1.近等基因系196

2.集团分离分析197

3.近等基因系和集团分离分析的作用198

（四）主效基因的定位198

1.利用已有的遗传图谱进行定位198

2.在构建分子图谱的同时进行定位198

二、物理图199

（一）物理图的类型199

1.限制性酶切图谱199

2.重叠群图谱199

3.DNA序列图谱203

（二）长距离物理作图203

三、图位克隆法的主要策略和相关技术203

（一）染色体步移203

1.图位克隆法中的染色体步移204

2.YAC末端的遗传作图204

3.目标基因的鉴定205

4.有关染色体步移的几个问题205

（二）染色体登陆206

1.染色体登陆的含义206

2.染色体登陆对分子标记的要求206

3.染色体登陆的具体步骤206

4.染色体登陆的实例207

5.染色体登陆的优越性及其应用前景207

（三）相关技术207

1.质粒挽救法207

2.反向PCR法208

3.TAIL-PCR法209

第十六章 酿酒酵母的遗传工程214

一、酵母菌的质粒215

（一）天然的酵母菌质粒215

（二）人工构建的酵母菌质粒216

1.酵母菌的整合型质粒217

2.酵母菌的游离型质粒218

3.酵母菌的复制型质粒218

4.酵母菌的着丝粒质粒218

5.酵母菌的线状质粒219

二、酵母菌基因的克隆219

（一）酵母菌基因在大肠杆菌中的表达219

（二）利用大肠杆菌突变体克隆酵母菌基因220

（三）利用酵母菌突变体克隆酵母菌基因220

（四）酵母菌的转化221

1.利用乙酸锂进行转化221

2.利用原生质体进行转化221

三、外源基因在酵母菌中的表达222

（一）酵母菌的表达载体222

（二）影响表达的因素223

（三）蛋白质的分泌223

（四）内含子切除问题224

四、利用酵母菌研究分子生物学224

（一）基因融合系统224

（二）克隆化基因与酵母染色体的整合225

（三）基因置换技术226

1.基因破坏一步法226

2.PCR介导的基因破坏一步法226

3.移换226

4.用一步整合置换创造修饰基因228

（四）回收者载体的应用230

第十七章 植物基因工程233

一、概论233

（一）植物基因工程的受体233

（二）植物基因工程载体233

二、农杆菌介导的基因转移235

（一）农杆菌转化载体的改造236

1.Ti质粒的一般特性236

2.整合载体237

3.双元载体237

（二）农杆菌转化技术237

1.农杆菌的寄主范围237

2.农杆菌转化的方法237

三、其他植物转基因方法239

（一）基因枪转化系统239

1.基因枪转化的原理和特点239

2.影响基因枪转化的因素240

（二）原生质体转化系统241

1.电击法241

2.PEG介导法242

3.脂质体介导法242

（三）生殖细胞转化242

1.花粉介导的遗传转化242

2.子房作为受体243

（四）病毒载体法243

四、转化体的鉴定和分析243

（一）转化体的选择243

（二）转化体的鉴定244

（三）外源基因的整合特性245

（四）外源基因在转化体中的表达情况245

（五）外源基因在转化体中的传代分离及其稳定性246

五、转基因技术在植物育种上的应用247

（一）抗病毒基因工程247

（二）抗虫性基因工程247

（三）抗除草剂基因工程247

（四）抗真菌、细菌病害的基因工程248

第十八章 哺乳动物的基因工程249

一、动物基因工程载体系统249

（一）反转录病毒载体249

1.一般特性249

2.反转录病毒载体的构建250

（二）SV40病毒载体253

1.一般特性253

2.SV40载体的构建255

（三）腺病毒载体257

1.一般特性257

2.腺病毒载体的构建方法258

（四）腺相关病毒载体258

（五）单纯疱疹病毒载体258

（六）牛痘病毒载体259

（七）牛乳头瘤病毒载体259

（八）非病毒载体260

二、动物基因工程的标记基因260

（一）选择标记基因260

1.胸苷激酶基因261

2.黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）基因262

3.氨基葡萄糖苷3′-磷酸转移酶基因262

4.二氢叶酸还原酶基因263

（二）报告基因263

1.氯霉素乙酰转移酶基因263

2.β-半乳糖苷酶基因264

3.碱性磷酸酶基因264

4.萤光素酶基因264

5.绿色荧光蛋白基因264

6.红色荧光蛋白基因265

三、外源基因的导入与表达265

（一）哺乳动物细胞的基因导入方法265

1.磷酸钙沉淀法265

2.脂质体介导法266

3.电击法266

（二）动物转基因技术266

1.胚胎显微注射267

2.反转录病毒载体267

3.胚胎干细胞方法268

4.精子介导基因转移法268

（三）外源基因在哺乳动物细胞中的表达268

1.瞬时表达268

2.外源基因整合后的表达269

（四）外源基因在转基因动物中的表达269

四、基因打靶与体细胞克隆技术269

（一）基因打靶的分子生物学基础270

（二）基因打靶载体270

1.插入型载体271

2.置换型载体271

（三）基因打靶的策略271

1.基因敲除271

2.进退策略272

3.标记和交换策略272

4.双置换法273

5.Cre／loxP重组系统策略273

（四）基因打靶的筛选和选择系统274

1.物理筛选275

2.遗传选择275

（五）体细胞基因打靶276

（六）体细胞克隆技术277

1.受体细胞的选择与去核278

2.供体细胞的选择278

3.核移植与重构胚的激活278

五、转基因动物的应用279

（一）动物乳腺生物反应器279

（二）动物血液生物反应器280

（三）抗病育种280

（四）生产性能的改良281

（五）异种器官移植281

第十九章 用重组DNA技术生产药物285

一、胰岛素285

（一）人胰岛素的结构286

（二）胰岛素“基因”的人工合成287

（三）利用胰岛素原cDNA生产胰岛素288

（四）细菌分泌胰岛素288

二、干扰素288

（一）人干扰素的结构与功能288

（二）人干扰素αcDNA的克隆和表达289

（三）人干扰素γ基因的高效表达290

三、乙型肝炎病毒疫苗291