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第一章　显微技术1

第一节　显微镜1

一、明视野光学显微镜1

［实验1-1］明视野显微镜3

二、其他光学显微镜5

［实验1-2］暗视野显微镜5

［实验1-3］相差显微镜7

［实验1-4］荧光显微镜10

三、电子显微镜11

［实验1-5］细菌、酵母菌超薄切片的透射电镜观察13

［实验1-6］噬菌体的透射电镜观察14

［实验1-7］酵母细胞的扫描电镜观察15

第二节　显微摄影16

第二章　工业微生物形态与观察20

第一节　细菌20

［实验2-1］细菌细胞的单染色及形态观察21

第二节 放线菌25

［实验2-2］放线菌的形态观察27

第三节　噬菌体27

［实验2-3］噬菌体的分离与纯化31

［实验2-4］高效价噬菌体原液的制备32

［实验2-5］溶源菌的鉴定33

第四节　酵母菌34

［实验2-6］酵母菌细胞形态观察36

［实验2-7］酵母菌巨大菌落观察36

第五节　小型丝状真菌（霉菌）37

一、藻状菌（主要指根霉、毛霉、犁头霉）37

［实验2-8］根霉、毛霉的形态观察39

二、曲霉40

三、青霉40

［实验2-9］青霉、曲霉的形态观察41

四、其他霉菌43

第六节　食用真菌45

［实验2-10］平菇的瓶栽46

第七节　藻类46

［实验2-11］螺旋藻的培养47

第三章　工业微生物细胞一般结构与特殊结构的观察48

第一节 染色48

一、染色的基本原理48

二、染料48

三、染色50

［实验3-1］活体染色50

［实验3-2］单染色50

［实验3-3］负染色50

［实验3-4］抗酸性染色51

［实验3-5］革兰氏染色52

［实验3-6］荧光染色与观察55

第二节　细胞各部结构成分的分离与观察57

［实验3-7］革兰氏阳性菌细胞壁的制备58

［实验3-8］细胞壁的形态观察59

［实验3-9］细菌荚膜的观察60

［实验3-10］细菌鞭毛的观察61

［实验3-11］微生物细胞核的观察62

［实验3-12］异染颗粒的观察63

［实验3-13］胞内脂肪颗粒和肝糖颗粒的观察64

［实验3-14］酵母液泡的提取65

［实验3-15］酵母线粒体的制备66

第三节　芽孢、子囊孢子、假菌丝和菌丝的观察67

一、芽孢67

［实验3-16］芽孢形成及发芽的观察（附伴孢晶体的观察）69

二、酵母子囊孢子70

［实验3-17］子囊孢子的形成及观察71

三、酵母假菌丝与霉菌真菌丝72

［实验3-1 8］假菌丝的观察72

［实验3-19］霉菌菌丝生长的观察73

第四章　工业微生物纯培养技术74

第一节　消毒与灭菌74

一、热杀菌74

二、化学品消毒76

三、紫外线和放射线77

四、空气灭菌77

五、过滤除菌78

［实验4-1］微孔滤膜滤器的使用80

六、防霉83

［实验4-2］防霉剂的选用83

第二节　培养基及其配制85

一、培养基85

二、培养基成分86

［实验4-3］麦芽汁培养基的配制88

第三节　分离、接种和培养88

一、分离88

［实验4-4］试管倾倒培养皿分离法89

［实验4-5］稀释平皿分离91

［实验4-6］平皿划线分离93

二、接种95

［实验4-7］接种技术95

三、摇瓶与发酵97

［实验4-8］摇瓶发酵生产柠檬酸100

［实验4-9］小型连续发酵实验103

［实验4-10］酿酒酵母的同步培养104

［实验4-11］厌氧罐分离培养厌氧微生物107

第五章　培养条件对工业微生物生长与发酵的影响109

第一节　温度109

［实验5-1］酵母营养细胞致死时间的测定111

第二节　水活度与渗透压112

［实验5-2］培养基中糖和盐浓度对微生物生长的影响113

第三节　氧和氧化还原电位114

［实验5-3］微生物生长对氧的要求116

［实验5-4］培养液氧化还原值（rH）的测定117

［实验5-5］溶解氧的测定（碘量法）117

［实验5-6］BOD的测定119

［实验5-7］发酵液COD测定121

第四节　酸碱度122

［实验5-8］pH对微生物的影响124

第五节　重金属和一些化合物对微生物的抑制作用124

［实验5-9］滤纸片法测定重金属对微生物的影响125

［实验5-10］消毒剂杀菌力的测定126

第六节　表面张力128

［实验5-11］表面张力对微生物的影响128

第七节　极端环境因素对微生物的影响129

第六章　工业微生物的生理与发酵试验130

第一节　微生物对碳源的利用130

［实验6-1］细菌对糖、醇及糖苷的利用131

［实验6-2］酵母对糖类的发酵132

第二节　微生物对氮源的利用132

［实验6-3］细菌对硝酸盐的还原作用132

［实验6-4］酵母对氮源的利用133

第三节 细菌鉴定中的某些特殊生理实验134

［实验6-5］淀粉水解134

［实验6-6］V-P试验（乙酰甲基甲醇试验）135

［实验6-7］硫化氢的生成136

［实验6-8］吲哚试验136

［实验6-9］过氧化氢酶的产生137

［实验6-10］明胶液化试验138

［实验6-11］石蕊牛乳试验139

［实验6-12］甲基红试验（M-R）140

［实验6-13］乙醇的氧化140

［实验6-14］乙酸的氧化141

［实验6-15］脲酶的测定141

第四节　常用细菌的分离和检测142

［实验6-16］枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）142

［实验6-17］醋酸细菌143

［实验6-18］乳酸菌145

［实验6-19］德氏乳杆菌147

［实验6-20］丙酸细菌149

［实验6-21］丁酸梭菌（Clostridium butyricum）150

第五节　酵母应用特性的测定152

［实验6-22］酵母发酵力的测定152

［实验6-23］压榨酵母发酵力的测定153

［实验6-24］面包酵母发面力的测定154

［实验6-25］酵母忍耐酒精浓度的测定155

［实验6-26］酵母抵抗防腐剂能力的测定156

［实验6-27］啤酒酵母凝絮力的测定157

一、Gilliland法157

二、Helm法158

三、本斯值法159

四、光密度改良法（江南大学发酵工程系研究改良）160

［实验6-28］啤酒酵母产生双乙酰的测定160

第六节　发酵制品的实验161

［实验6-29］细菌液化型淀粉酶的发酵及活力测定161

［实验6-30］曲霉的葡萄糖淀粉酶生成和活力测定162

［实验6-31］米曲霉的蛋白酶生成及活力测定163

［实验6-32］纤维素酶的发酵及其活力测定163

［实验6-33］乳酸发酵及测定166

［实验6-34］乳酸菌饮料167

［实验6-35］葡萄酒饮料168

［实验6-36］发酵法酿制食醋169

第七章　发酵过程及发酵食品中微生物的检测171

第一节　微生物生长、大小和数量的检测方法171

一、细胞质量测定171

二、细胞菌数测定法171

［实验7-1］酵母细胞数的测定171

［实验7-2］酵母细胞大小的测量173

［实验7-3］细菌增殖曲线的测定174

［实验7-4］丝状真菌生长速率的测定176

第二节　发酵和食品工业中常见的微生物种类及其概测177

一、发酵和食品工业中常见微生物的种类177

二、发酵和食品工业中常见微生物类别的概测178

第三节　发酵和食品工业用水和发酵过程微生物数量的检测183

一、发酸和食品工业用水微生物数量的测定183

［实验7-5］水中细菌数的测定183

［实验7-6］水中大肠菌群数量的测定184

［实验7-7］水中大肠杆菌数量的测定186

［实验7-8］大肠杆菌的简易检出法188

二、酒醅中微生物总数测定189

［实验7-9］酒醅中微生物数量的测定189

［实验7-10］固态发酵水浆厌氧微生物的分离189

［实验7-11］啤酒生产中细菌、霉菌及野生酵母的检测190

第四节　培养皿或试管中菌落总数的确定191

第八章 自然界工业微生物资源的筛选192

第一节　工业微生物获得的一般途径192

一、目的工业微生物应具备的特性192

二、工业微生物的来源192

三、分离和筛选微生物192

第二节　工业菌种筛选程序193

一、采样193

二、选择性培养与富集培养193

三、培养分离194

四、筛选195

五、毒性试验195

第三节　培养分离195

一、自然界中细菌的分离195

［实验8-1］土中细菌的直接分离196

［实验8-2］土中细菌的富集培养与分离197

［实验8-3］水中细菌的直接分离198

［实验8-4］水中细菌的滤膜压印分离法199

二、放线菌的分离199

［实验8-5］土样中放线菌的非选择性分离201

三、真菌分离202

［实验8-6］土样中真菌的压贴分离203

［实验8-7］担子菌组织分离法204

［实验8-8］担子菌孢子分离204

四、目标菌株的分离、筛选实例205

［实验8-9］利用碱法纸浆废液的微生物的分离205

［实验8-10］葡萄酒酵母的筛选205

［实验8-11］耐高渗压产甘油酵母的筛选206

［实验8-12］生产选种207

第九章　工业菌种的育种技术208

第一节　富集培养技术在育种中的应用209

一、去调节突变株的分离209

二、营养缺陷型的富集210

三、富集法在研究次级代谢的重组DNA技术中的应用212

第二节　诱变育种213

一、诱变剂和诱变处理213

二、诱变育种步骤216

［实验9-1］紫外线的诱变育种218

［实验9-2］亚硝基胍诱变曲霉菌（黑曲露、米曲霉）219

［实验9-3］链霉菌菌丝体的诱变育种219

第三节　定点突变221

［实验9-4］产甘油假丝酵母核糖体蛋白L41基因定点突变223

第四节　营养缺陷型的选育225

一、诱变方法226

二、淘汰野生型226

三、检出缺陷型226

四、营养缺陷型生长谱的确定228

［实验9-5］大肠杆菌营养缺陷型的筛选231

［实验9-6］酵母营养缺陷型的筛选233

［实验9-7］青霉菌营养缺陷型菌株的筛选234

第五节　呼吸缺陷型及代谢调节突变株的筛选235

一、呼吸缺陷型菌株的筛选235

［实验9-8］酵母呼吸缺陷型的筛选235

二、代谢调节突变株的筛选236

［实验9-9］氨基酸抗反馈调节突变株的选育237

第六节　抗噬菌体菌株的选育238

［实验9-10］抗噬菌体产α-淀粉酶菌株的选育238

第七节　基因重组育种239

一、细菌接合杂交240

［实验9-11］细菌的接合240

二、酵母杂交育种技术241

［实验9-12］酵母单倍体的分离与鉴定243

［实验9-13］罕见交配法转移酵母杀伤质粒245

第八节　原生质体育种247

一、原生质体融合育种的特点248

二、原生质体融合育种步骤251

三、原生质体融合育种的要点251

四、原生质体转化261

五、原生质体再生率和融合率计算264

［实验9-14］芽孢杆菌的原生质体融合264

［实验9-15］链霉菌属原生质体融合267

［实验9-16］小单胞菌的原生质体融合269

［实验9-17］酵母的原生质体融合271

［实验9-18］丝状真菌的原生质体融合273

［实验9-19］原生质体融合法转移酵母线粒体及杀伤质粒276

［实验9-20］枯草芽孢杆菌属间原生质体转化278

［实验9-21］质粒DNA转化链霉菌原生质体279

［实验9-22］丝状真菌原生质体转化280

［实验9-23］紫外线诱变原生质体选育苏氨酸高产菌283

六、原生质体技术中的一些特殊技术283

七、原生质体电融合技术285

［实验9-24］电诱导酵母原生质体融合285

第九节　突变与重组的结合应用287

第十章　工业菌种改良的基因工程技术289

第一节　分子生物学技术289

一、GC含量测定289

［实验10-1］热变性温度法测定GC含量290

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术291

［实验10-2］SDS-PAGE291

［实验10-3］聚丙烯酰胺凝胶的等电聚焦电泳295

三、DNA和RNA的定量测定297

［实验10-4］紫外分光光度法DNA的定量测定297

［实验10-5］溴化乙锭-塑料薄膜法DNA的定量测定297

四、核酸分子杂交技术298

［实验10-6］缺口平移法制备DNA探针300

［实验10-7］随机引物标记法302

［实验10-8］RNA探针的制备304

［实验10-9］Dig-核酸探针的制备305

［实验10-10］光敏生物素标记核酸探针的制备306

［实验10-11］凝胶中DNA转移至硝酸纤维膜（Southern blot）307

［实验10-12］菌落原位杂交308

［实验10-13］放射性核素标记核酸探针的杂交310

［实验10-14］地高辛标记核酸探针的杂交及显色311

［实验10-15］生物素标记核酸探针的杂交及显色312

第二节　基因工程的基本过程和原理313

一、载体313

二、DNA重组用酶315

［实验10-16］PCR技术320

第三节　大肠杆菌基因工程321

一、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化321

［实验10-17］用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌（1）322

［实验10-18］用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌（2）323

［实验10-19］用PEG制备和转化大肠杆菌感受态细胞323

［实验10-20］大肠杆菌的电击转化324

二、大肠杆菌中质粒的提取与纯化325

［实验10-21］质粒的大量提取与纯化326

［实验10-22］质粒的小量提取327

［实验10-23］用硅胶膜分离法小量提取质粒328

三、微生物染色体DNA的提取与PCR扩增329

［实验10-24］枯草杆菌染色体DNA的提取329

［实验10-25］真菌染色体DNA的简易提取方法329

［实验10-26］枯草杆菌淀粉酶基因的PCR扩增330

［实验10-27］从电泳凝胶中分离枯草杆菌淀粉酶基因331

四、外源基因在大肠杆菌中的高表达332

［实验10-28］载体和基因的酶切336

［实验10-29］基因与载体的连接336

第四节　非大肠杆菌微生物基因工程340

一、芽孢杆菌基因工程340

［实验10-30］枯草杆菌感受态细胞的制备和转化341

［实验10-31］地衣芽孢杆菌感受态细胞的诱导形成及其高效电转化342

［实验10-32］枯草杆菌转化子质粒的提取和检测342

［实验10-33］高碱性蛋白酶基因多拷贝重组菌的构建344

二、棒杆菌基因工程345

［实验10-34］适用于异源DNA整合转化的谷氨酸棒杆菌电转化法346

［实验10-35］谷氨酸棒杆菌温度和溶菌酶敏感菌株的构建346

三、根癌农杆菌基因工程348

［实验10-36］双元载体质粒导入根癌农杆菌的电击转化法348

［实验10-37］根癌农杆菌介导产甘油假丝酵母的遗传转化350

第五节　酵母基因工程351

一、酵母的载体351

二、酵母的表达载体352

［实验10-38］酵母染色体DNA的提取353

［实验10-39］酿酒酵母的醋酸锂完整细胞转化法353

［实验10-40］单链载体DNA的制备354

［实验10-41］酵母菌质粒DNA的提取355

［实验10-42］巴斯德毕赤酵母的电转化方法356

三、实例　黑曲霉植酸酶基因在酿酒酵母中的高表达356

第十一章　工业微生物菌种保藏技术358

第一节　菌种的退化与防治措施358

一、菌种退化的现象358

二、菌种退化的原因359

三、防止退化的措施360

第二节　菌种保藏方法总览及一些菌种可以采用的保藏方法361

第三节　低温保藏362

一、斜面保藏法363

二、超低温冷冻保藏技术（－80～－60℃）363

［实验11-1］－80℃超低温保藏363

三、液氮冷冻保藏技术364

［实验11-2］液氮冷冻保藏364

第四节　冻干保藏366

［实验11-3］菌种冷冻干燥保藏366

第五节　其他保藏方法368

一、矿物油中浸没保藏368

［实验11-4］液体石蜡保藏菌种369

二、干燥-载体保藏369

［实验11-5］快速沙土管保藏法369

［实验11-6］其他干燥-载体保藏法370

第六节　基因工程菌的保藏371

第七节　微生物活力和稳定性测定371

第八节　常用菌种保藏培养基372

一、细菌保藏用培养基372

二、放线菌用保藏培养基373

三、酵母菌株用保藏培养基373

四、丝状真菌用保藏培养基373

第九节　著名菌种保藏及专利菌种保藏机构374

一、中国微生物菌种保藏管理委员会组织系统374

二、国际确认的专利菌种保藏机构（IDA）375

第十二章　微生物细胞固定化技术376

第一节　载体结合法376

一、表面吸附法377

二、共价结合法377

第二节　交联法378

第三节　包埋法378

一、藻酸钙凝胶包埋法378

［实验12-1］酿酒酵母的藻酸钙固定化380

［实验12-2］固定化枯草杆菌连续生产耐热α-淀粉酶381

二、κ-角叉胶包埋法383

［实验12-3］κ-角叉胶一步包埋法383

［实验12-4］κ-角叉胶二步包埋法385

［实验12-5］固定化酵母连续生产酒精385

［实验12-6］固定化细胞的回收与活细胞计数386

三、聚丙烯酰胺凝胶包埋法386

［实验12-7］大肠杆菌的聚丙烯酰胺凝胶固定化387

四、光交联树脂前聚体包埋法388

［实验12-8］光交联树脂固定化原生质体388

五、其他载体包埋方法388

第四节　几种固定化细胞方法联用390

一、包埋-交联法390

二、吸附-交联法391

三、包埋-吸附法391

第五节　其他固定化方法391

第六节 固定化微生物细胞方法的选择392

一、固定化微生物细胞方法的选择392

二、固定化细胞技术的评价指标393

第十三章　酶固定化技术394

第一节　概述394

第二节　吸附法394

一、几丁质载体上酶的吸附固定395

［实验13-1］吸附法几丁质固定化酶的制备395

二、疏水吸附法396

［实验13-2］疏水吸附法固定化酶的制备397

三、亲和吸附法398

［实验13-3］亲和吸附法固定L-维生素C氧化酶398

［实验13-4］亲和吸附交联法固定蔗糖酶398

［实验13-5］葡萄糖氧化酶的免疫固定化399

四、过渡金属介导法399

［实验13-6］过渡金属介导葡萄糖淀粉酶固定于控孔玻璃399

［实验13-7］过渡金属介导葡萄糖淀粉酶固定化改良法400

第三节　包埋法400

一、凝胶聚合包埋法401

二、辐射聚合包埋法401

［实验13-8］辐射共聚合包埋法固定葡糖淀粉酶402

三、酶蛋白共聚合包埋法402

［实验13-9］酰化共聚合包埋法固定α-糜蛋白酶402

四、交联多聚物凝胶包埋法403

［实验13-10］明胶交联包埋法403

［实验13-11］明胶交联法制备固定化双酶膜404

［实验13-12］聚乙烯醇交联包埋法404

［实验13-13］脱乙酰几丁质交联包埋法405

五、移植共聚合包埋法405

［实验13-14］移植共聚合包埋法406

六、物理定位法406

第四节　共价交联法407

一、溴化氰交联法407

［实验13-15］溴化氰交联滴定法407

［实验13-16］三乙烯胺-溴化氰活化法408

［实验13-17］溴化氰活化法制备可溶性载体固定化酶409

二、碳化二亚胺法410

［实验13-18］碳化二亚胺二步法固定基氧化酶410

三、戊二醛交联法411

［实验13-19］戊二醛交联固定化葡萄糖氧化酶411

四、交联聚乙烯亚胺法412

［实验13-20］裱涂载体的制备及用于酶固定化412

五、活性载体法413

第十四章　工业微生物实验室常见的一些单元操作技术414

第一节　搅拌和振荡414

一、搅拌器414

二、导管和密封415

三、电动机416

四、振荡416

第二节　气体的计量和导入416

第三节　加热和冷却417

一、加热417

二、冷凝器417

三、冷却剂419

第四节　减压操作420

一、真空的产生420

二、真空的测量421

三、真空操作422

第五节　干燥423

一、气体的干燥423

二、液体的干燥423

三、固体的干燥424

四、干燥剂424

第六节　过滤和离心425

第七节　简单蒸馏427

第八节　纸层析428

一、流动相的制备429

二、点样429

三、展开430

四、显色430

第九节　薄层层析430

一、五块层析板的一次涂布431

二、点样431

三、展开431

四、斑点的显色和鉴定432

第十节　溶液的脱色432

第十一节　密度的测定432

第十二节　折光率433

第十三节 比旋光度433

第十四节　硅化434

一、蒸发硅化434

二、浸没硅化435

第十五节　透析袋的准备435

第十六节　天平的使用与维护435

一、机械分析天平435

二、电子天平436

第十七节　分光光度计波长的校正438

参考文献439

附录441

一、实验室生物安全防护等级与受体生物安全等级441

二、实验室安全及防护知识442

三、实验室常识444

四、玻璃器皿的洗涤及各种洗液的配制445

五、缓冲液447

六、一些有机物质的性质454

七、指示剂457

八、冷却剂和吸水剂459

九、硫酸铵饱和度的常用表460

十、试剂的配制及一些常用数据表462

十一、限制性酶和甲基化酶468

十二、有关蛋白质的一些数据488

十三、离心机转数（r/min）与相对离心力（RCF）的换算492

十四、本书使用的英文缩写493