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第1章　绪论1

背景1

目录1

前言1

环境的控制4

组织培养的优点4

专业技能5

局限性5

样品的特征和均一性5

经济、规模和机械化5

体内模型5

不稳定性6

细胞的起源6

量的问题6

去分化和选择6

组织培养的类型7

体外的主要差异7

细胞黏附10

培养细胞的环境10

第2章　培养细胞的生物学10

细胞黏附分子11

细胞周期12

细胞增殖12

细胞骨架12

细胞增殖的控制13

细胞去分化14

细胞分化的维持14

细胞分化14

能量代谢17

细胞系的演化18

培养的开始18

细胞的衰老19

连续细胞系的形成20

培养细胞的起源21

规划23

第3章　设计与布局23

建设与使用26

无菌操作区27

布局27

温室28

培养箱28

洗涮32

准备32

操作台32

储存33

组织培养实验室的要求36

第4章　设备36

洁净台37

必需设备37

培养箱38

除菌器39

CO2培养箱39

冰箱和冷冻箱41

清洗42

倒置显微镜42

水的纯化43

除菌和干燥43

冷藏器44

离心机44

细胞计数器45

辅助设备45

天平45

血细胞计数板45

抽气泵46

温度记录仪47

解剖镜47

pH计47

电导仪47

渗透压计47

普通显微镜47

液体操作48

滚动架48

磁力搅拌器48

玻璃器皿清洗机53

低温冷冻箱53

其他常用设备53

视频摄像机和显示器54

消耗性物品55

流式细胞仪55

集落计数器55

可控速率冷冻箱55

离心淘洗机55

无菌容器56

培养器皿56

吸管56

除菌过滤57

注射器和针头57

无菌的维持58

无菌技术的目标58

第5章　无菌技术58

工作面59

安静的工作区域59

创造无菌环境的各种因素59

培养物61

试剂和培养基61

个人卫生61

灼烧62

加盖62

灭菌操作62

擦拭62

移液63

试剂瓶和培养瓶的操作63

层流64

倒出液体64

方案5.1　在洁净台内进行无菌操作66

标准方法66

方案5.2　在敞开的工作台上进行操作68

方案5.3　培养皿和培养板的操作70

培养平皿和多孔培养板70

培养箱71

仪器和设备71

训练72

充入CO2气体72

盒装培养物72

危险性评估74

第6章　安全性74

安全规则76

标准操作程序76

设备77

操作者77

常规安全77

玻璃器皿和锐利的物品78

气体79

化学毒性79

火80

液氮80

生物危害性81

高能源81

放射性81

摄入81

标记的试剂81

防范水平82

人的活检材料84

丢弃物处理85

遗传操作85

附着材料86

细胞的附着和生长86

第7章　培养器皿86

附着物86

细胞产量87

培养器皿的选择87

悬浮培养89

制样和分析90

通风90

价格91

不均匀生长91

透性支持物92

特殊系统92

基质覆盖93

表面处理93

方案7.1　细胞外基质（ECM）的制备94

三维基质95

饲养层95

非黏附性附着面96

各种人工附着面96

液-胶或液-液界面97

pH98

物理化学特征98

第8章　培养基98

培养基的发展史98

CO2和碳酸盐99

方案8.1　pH标准色阶的制备99

氧气101

缓冲作用101

温度102

渗透压102

表面张力和成泡性103

黏滞度103

完全培养基104

平衡盐溶液104

氨基酸105

有机补充物106

葡萄糖106

维生素106

盐类106

血清112

抗生素112

激素和生长因子112

生长因子113

蛋白质113

矿物质115

脂类115

激素115

营养物及代谢物115

培养基和血清的选择116

抑制物116

血清的测试118

批次预约118

胚胎浸出液119

其他添加物119

热灭活119

适应性培养基120

使用含血清的培养液的缺点121

第9章　无血清培养液121

无血清培养液的优点122

血清的替代123

无血清培养液的缺点123

具有选择性123

调节细胞增殖、分化123

生长因子124

激素124

传代培养124

无血清培养液的选择138

基质138

血清中的营养物质138

蛋白质和多聚胺138

血清替代物139

无血清培养液的商业供应139

小结142

无血清培养基的制备142

无血清培养液的研发142

玻璃器皿144

设备144

第10章　准备与灭菌144

方案10.1　玻璃器皿的准备和灭菌147

方案10.2　移液管的准备和灭菌150

移液管150

螺口盖151

方案10.3　螺口盖的准备和灭菌153

种类繁杂的设备154

清洁剂的选择154

方案10.4　过滤装置的灭菌155

可重复使用的灭菌过滤器155

试剂和培养基156

水157

平衡盐溶液158

培养基159

方案10.5　BSS的制备159

方案10.6　用1×储存液制备培养基160

方案10.7　用10×浓缩液配制培养基161

方案10.8　以干粉配制培养基164

干粉培养基164

特制培养基165

方案10.9　特制培养基的准备166

除菌过滤168

灭菌168

方案10.11　使用过滤瓶的灭菌过滤171

方案10.10　用注射器式过滤器进行灭菌过滤171

方案10.12　使用小型直线式过滤器的灭菌过滤172

血清173

方案10.13　使用大型直线式过滤器进行灭菌过滤173

方案10.14 血清的收集与灭菌174

方案10.15　血清的透析176

无菌检测177

质量控制177

其他试剂的准备与灭菌177

培养基的质控、检测和储存177

培养检测178

保存179

组织分离180

原代培养的类型180

第11章　原代培养180

方案11.1　分离小鼠胚胎182

小鼠胚胎细胞培养182

方案11.2　分离鸡胚183

鸡胚细胞培养183

人体活检材料186

原代外植188

原代培养188

方案11.3　人体活检组织188

方案11.4　原代外植189

酶的解离作用191

方案11.5　胰酶的温消化192

方案11.6　胰酶的冷消化195

低温预处理的胰酶消化195

方案11.7　鸡胚器官原基196

鸡胚器官原基196

其他酶解过程200

方案11.8　用胶原酶消化201

胶原酶201

方案11.9　利用筛网的机械分离法203

机械消化203

方案11.10　富集存活细胞205

分离活细胞205

原始记录207

原代培养小结207

传代培养和扩增208

命名208

第12章　细胞系208

细胞系的命名212

细胞系的永生化212

细胞系的选择213

细胞形态学214

常规培养214

方案12.1　更换培养基215

体积、深度和表面积215

培养基的更换215

传代216

维持培养基216

传代标准217

方案12.2　传代218

传代比率和生长周期220

悬浮培养细胞的增殖222

传代时的细胞浓度222

方案12.3　悬浮细胞传代224

悬浮培养物的传代224

培养记录225

抗生素的使用225

克隆培养228

第13章　克隆培养及筛选228

方案13.1　稀释法克隆培养229

贴瓶率的激活231

促进克隆生长的方法232

饲养层细胞233

方案13.2　条件培养基的制备233

条件培养基233

方案13.3　饲养层的准备234

方案13.4　琼脂中克隆培养235

悬浮克隆培养235

方案13.5　美希索中克隆培养238

方案13.6　用克隆环分离细胞克隆240

克隆的分离240

方案13.7　辐射法分离细胞集落242

方案13.8　悬浮细胞克隆的分离243

悬浮细胞克隆243

单层贴壁细胞克隆的其他分离技术243

选择性抑制剂244

复制性培养244

方案13.9甲氨蝶呤抗性和DHFR扩增246

遗传变异细胞的筛选246

选择性黏附247

细胞与基质的相互作用247

基质的性质248

选择性解离248

半固体培养基251

选择性饲养层251

方案14.1　密度梯度细胞分离法253

细胞密度及等密度沉降法253

第14章　细胞分离253

免疫盘化法257

免疫磁珠分离法257

基于抗体的分离技术257

方案14.2　磁性激活的细胞分选法（MACS）260

离心淘洗分离技术261

细胞体积与沉降速度261

荧光激活的细胞分选法262

其他分离技术265

初试细胞分离者的选择266

鉴定的需要268

第15章　细胞鉴定268

谱系或组织标记269

种属鉴定269

独特的标记270

形态学271

转化271

方案15.1　倒置显微镜的使用273

显微镜使用273

方案15.2　GIEMSA染色274

染色274

方案15.3　结晶紫染色275

细胞学检查所用培养器皿276

方案15.4　涂片制备277

悬浮细胞细胞学检查标本的制备277

方案15.5　细胞离心机278

方案15.6　过滤细胞学279

方案15.7　利用胶片进行显微照相280

照相技术280

方案15.8　显微镜电子成像282

电子影像记录282

方案15.9　染色体制备283

染色体分析283

染色体显带技术285

变异286

染色体分析286

DNA指纹技术288

DNA杂交288

染色体染色288

DNA含量288

方案15.10　细胞系的多位点DNA指纹检测289

原理289

同工酶295

酶活性295

RNA和蛋白质295

方案15.11　同工酶分析296

原理296

抗原标记299

多样性299

分析299

方案15.12　间接免疫荧光301

证明302

分化302

其他方法302

去分化304

表现型的体内表达304

第16章　分化304

增殖和分化305

定向和分化的各个阶段305

定向和细胞谱系306

分化标记物307

可溶性诱导剂308

诱导分化308

旁分泌生长因子311

细胞的相互作用311

细胞-基质相互作用312

负向作用的旁分泌因子312

极性和细胞形状313

应用方面314

分化和恶性314

细胞系特性的作用316

第17章　转化316

什么是转化？317

遗传不稳定性318

永生性319

DNA含量319

染色体畸变319

病毒基因的永生性320

衰老的控制320

方案17.1 成纤维细胞的永生性321

人类成纤维细胞的永生性321

转染后的培养物培养324

停泊非依赖性325

生长控制的异常325

端粒酶诱导的永生性325

转基因小鼠325

接触抑制326

方案17.2　细胞增殖的密度限制328

血清依赖性329

恶性肿瘤330

肿瘤发生330

侵袭性331

致瘤作用331

血管形成332

纤溶酶原激活剂333

污染源334

第18章　污染334

操作人员的技术336

潮湿培养箱337

使用和维护洁净台的层流337

环境337

无菌材料338

冷冻储藏338

方案18.1　清洁培养箱338

污染的检测339

微生物污染的种类339

引入的细胞系和活检339

检疫339

支原体340

可见的微生物污染340

原则342

方案18.2　荧光检测支原体343

方案18.3　消灭微生物的污染345

细菌、真菌和酵母345

病毒污染345

污染的去除345

持久的污染346

病毒污染的消除346

支原体的消除346

交叉污染347

结论348

细胞系的选择349

保存349

第19章　冷冻保存349

冷冻保存的必要性349

冷冻的理由349

冷冻保存的阶段350

培养条件的标准化350

方案19.1　冷冻细胞353

冷冻冰箱357

冷冻率357

方案19.2　融化冷冻细胞359

冷冻柜记录359

运送细胞361

细胞库361

连续置换361

活的培养362

冷冻安瓿362

方案20.1　用血细胞计数板进行细胞计数363

血细胞计数板363

第20章　定量363

细胞计数363

电子计数366

方案20.2　电子细胞计数367

细胞重量369

单层培养的染色369

细胞大小测定369

蛋白质370

方案20.3　用Hoechst 33258测定DNA370

DNA含量370

方案20.4　用Bradford方法测定蛋白质含量371

样品的溶解性371

方案20.5　DNA合成372

DNA合成372

合成率372

方案20.6　蛋白质合成373

蛋白质合成373

酶检测和免疫检测标本的制备374

重复取样问题375

流式细胞术375

细胞计数术375

原位标记375

细胞增殖376

数据分析376

数据的获得376

生长周期377

实验设计377

方案20.7　生长曲线，单层378

生长周期分析380

方案20.8　生长曲线，悬浮培养380

悬浮培养380

生长周期的变化382

方案20.9　贴壁效率383

贴壁效率383

自动集落计数384

方案20.10　3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的标记指数385

标记指数385

方案20.11　生长分数的测定387

生长分数387

细胞迁移388

细胞周期时间388

有丝分裂指数388

分裂指数388

导言389

第21章　细胞毒性389

分析的性质390

体外局限性390

方案21.1　染料排斥法测定细胞生存力391

生存力391

存活392

方案21.2染料摄取法测定细胞生存力392

方案21.3　克隆形成试验393

代谢测定397

细胞增殖测定397

方案21.4　基于MTT的细胞素性试验398

微滴定试验398

其他说明401

药物的相互作用403

微滴定与克隆的比较403

背景404

转化404

抗癌药物筛选404

前瞻性试验404

方案21.5　姐妹染色单体交换405

致癌性408

其他说明408

炎症反应409

上皮细胞410

第22章　特殊细胞的培养410

表皮411

方案22.1表皮角质形成细胞412

其他方法415

细胞特征415

方案22.2　角膜上皮细胞416

角膜416

乳腺418

方案22.3　乳腺上皮419

方案22.4　子宫颈部上皮420

子宫颈420

方案22.5　结肠直肠上皮424

胃肠道424

方案22.6　大鼠肝细胞的分离427

肝427

方案22.7　胰腺上皮429

胰429

肾431

方案22.8　肾上皮432

气管和支气管上皮433

方案22.9　气管和支气管上皮434

前列腺435

方案22.10　前列腺上皮436

脂肪组织438

结缔组织438

间充质细胞438

方案22.11　脂肪细胞的原代培养439

肌440

方案22.12　骨骼肌441

增殖和分化指数442

方案22.13　用藻酸盐微珠培养软骨细胞443

软骨443

其他说明和应用443

方案22.14　成骨细胞447

骨447

内皮细胞449

方案22.15　血管内皮细胞的培养450

神经细胞451

神经外胚层细胞451

方案22.16　小脑颗粒细胞的培养452

神经胶质细胞453

方案22.17　嗅球成鞘细胞455

方案22.18　黑素细胞的培养方法458

黑素细胞458

内分泌细胞458

造血细胞461

方案22.19　骨髓造血细胞的长期培养方法462

骨髓的长期培养462

方案22.20　造血细胞克隆形成的实验方法464

造血细胞集落形成实验464

胚层细胞467

生殖腺467

第23章　肿瘤细胞培养468

取材469

原代培养470

分离470

细胞系的建立471

肿瘤细胞的特征471

选择性培养基472

选择培养472

连续细胞系472

方案23.1　在汇合的饲养层上培养473

汇合的饲养层473

组织型培养475

悬浮克隆475

方案23.2　冻存活检标本476

冷冻组织保存476

异种移植476

结肠477

肺477

特殊肿瘤类型477

乳腺477

皮肤478

前列腺478

胰腺478

卵巢478

精原细胞瘤479

神经母细胞瘤479

子宫颈479

模型的选择480

相互作用480

第24章　器官型培养480

细胞的相互作用和表型表达480

气体和营养物质的交换481

器官培养481

器官培养的局限性482

生长与分化482

结构的完整性482

方案24.1　器官培养483

器官培养的类型483

中空纤维485

凝胶和海绵技术485

组织型培养485

方案24.2　球体培养486

球体486

藻酸盐活细胞固定术488

方案24.3　藻酸盐包围489

滤孔嵌套490

方案24.4　滤孔嵌套491

方案24.5　神经聚集物493

神经聚集物培养493

悬浮规模培养496

第25章　规模培养496

方案25.1　搅拌4L分批式悬浮培养497

连续培养499

搅匀和换气500

规模和复杂性500

方案25.2　Nunc细胞工厂503

多表面增殖503

单层规模培养503

旋转培养505

多列阵培养皿、螺旋柱和培养管505

方案25.3　旋转瓶培养506

微载体508

方案25.4　微载体509

灌流式单层培养510

细胞生长的监控511

第26章　特殊技术514

淋巴细胞的分离514

方案26.1　淋巴细胞的分离514

原始细胞的转化515

方案26.2　用PHA刺激淋巴细胞515

放射自显影术516

方案26.3　显微放射自显影术517

间隔性记录522

方案26.4　间隔性摄像523

共聚焦显微镜525

细胞同步化525

细胞分离525

阻断525

羊膜细胞培养526

方案26.5　羊膜细胞的培养526

冷血动物细胞的培养533

鱼细胞533

方案26.6～26.8　所用试剂和培养基534

方案26.6　从斑马鱼胚获得成纤维细胞饲养层535

方案26.7　斑马鱼胚细胞的原代培养536

方案26.8　建立斑马鱼胚细胞系537

方案26.9　昆虫细胞的扩增538

采用原位杂交技术对RNA基因表达的分析540

原位分子杂交540

方案27.1　原位杂交中的放射自显影技术540

细胞培养的分子生物学540

第27章　分子技术540

荧光原位杂交技术在基因及染色体分析中的应用546

方案27.2　利用单拷贝基因组探针及染色体刷漆进行荧光原位杂交546

体细胞融合549

方案27.3　细胞杂交551

杂交克隆的筛选552

单染色体移植553

单克隆抗体的制备553

移核实验553

方案27.4　单克隆抗体的制备554

转基因559

磷酸钙共沉淀560

方案27.5　磷酸钙介导DNA稳定转染560

脂质体介导的转染562

方案27.6　脂质体介导的瞬时转染562

电穿孔法564

方案27.7　电穿孔法稳定转染564

其他DNA转移方法566

报告基因567

方案27.8　β-半乳糖苷酶的原位染色567

方案27.9　氯霉素乙酰基转移酶（CAT）测定568

第28章　问题与对策570

细胞生长缓慢570

实验室是否发生其他变化？571

是否培养基出现问题？572

某些不稳定的试剂573

选择正确的培养基至关重要573

谷氨酰胺573

培养基的选择573

纯水器工作是否正常？574

配制培养基各种成分的纯度574

化学污染或玻璃蒸馏水器上是否有残留物？574

塑料管中是否有化学残留物？574

胰蛋白酶574

其他成分574

血清574

塑料制品575

血清575

玻璃器皿575

微生物污染575

抗菌素575

碳酸氢钠575

针对单一使用者576

针对多人共有的问题577

污染物的鉴定578

来自玻璃器皿的污染579

吸液管579

化学污染579

原代培养580

粉末或气溶胶580

原代培养常见的问题580

其他试剂580

水的纯度580

细胞选择有误581

污染581

如果克隆太弥散582

如果出现细胞贴壁效率降低582

如果每个培养皿中克隆数目过多582

克隆582

如果丧失产物形成能力583

如果细胞不发生分化583

饲养层583

常规单层培养583

分化583

如果细胞呈现不贴壁现象583

如果培养细胞出现非随机分布583

培养基584

老化584

生长不均匀584

交叉污染584

传代培养的细胞周期584

传代584

克隆培养584

冻存585

“治疗”585

如果复苏时活率不高585

“预防”585

“体征”585

细胞成颗粒性586

存货用磬586

细胞内出现颗粒586

污染586

冻存后细胞形态发生变化586

使用血球计数板587

细胞计数587

电子计数仪587

细胞外出现颗粒587

成活率检测588

形态学观察588

细胞毒性检测588

成活率588

结语589

附录：试剂及配制590

商业索引600

材料来源600

供应商和其他资源605

参考文献633

推荐参考书目671

相关杂志672

索引673

词汇表697

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