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1．为什么需要纯化酶？1

第一部分 建立纯化程序1

2．蛋白质纯化的策略和思路9

1．总体思路10

2．蛋白质来源15

3．提取16

4．批量纯化的步骤17

5．纯化的精制步骤18

6．结论19

参考文献19

3．生物信息学在蛋白质纯化方案设计中的应用21

1．从氨基酸序列中可以了解到什么22

2．仍不能预测到的是什么25

3．结论26

参考文献27

4．制作一张蛋白质纯化的汇总表29

1．引言29

2．脚注的重要性32

3．SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析对于主要蛋白质组分的价值32

4．常见的错误和问题32

第二部分 处理蛋白质和酶的常规方法32

5．建立一个实验室37

1．支撑材料38

2．分析检测的必要条件39

3．蛋白质分级的必要条件40

6．缓冲液：原理和操作43

1．引言43

2．理论44

3．缓冲液的选择45

4．缓冲液的准备48

5．挥发性缓冲液49

6．宽范围的缓冲液50

7．缓冲液储备液的配制50

参考文献56

7．酶活的测定57

1．引言58

2．催化活性的原理58

3．酶活性的测定64

4．反应分析混合物的配方设计69

5．讨论71

致谢71

参考文献71

8．蛋白质定量73

1．引言74

2．准备试剂的说明75

3．紫外光谱吸收方法80

4．染料染色蛋白质分析83

5．考马斯亮蓝蛋白质检测法（Bradford法）（范围：1-50μg）85

6．Lowry检测法（Alkaline Copper还原法）（范围：5-100μg）86

7．二喹啉甲酸检测法（BCA法）（范围：0.2-50μg）88

8．胺衍生法（范围：0.05-25μg）89

9．基于去垢剂的荧光检测法（范围：0.02-2μg）91

10．总论91

致谢94

参考文献94

9．蛋白质浓缩和其他溶解物的去除97

1．层析98

2．电泳103

3．透析104

4．超滤107

5．冷冻干燥113

6．沉淀116

7．结晶118

参考文献118

10．蛋白质稳定性的保持121

1．蛋白质失活的原因121

2．常规处理方法122

3．浓缩和溶解条件122

4．稳定性试验和储藏条件123

5．蛋白质水解和蛋白酶抑制剂124

6．蛋白质活性损失125

第三部分 重组蛋白质的表达和纯化125

11．有效表达重组蛋白质方法的选择131

1．引言132

2．大肠杆菌（Escherichia coli）133

3．毕赤酵母（Pichia pastoris）135

4．杆状病毒／昆虫细胞136

5．哺乳动物细胞138

6．蛋白质特性139

7．重组蛋白质的应用143

8．结论144

参考文献144

12．细菌系统内外源蛋白质的表达149

1．引言150

2．用E.coli表达外源蛋白质150

3．设计一个细菌表达方案151

4．方案条件的评估152

5．目标蛋白的分析152

6．克隆153

7．准备T4 DNA聚合酶-处理的DNA片段155

8．E.coli细胞质中的表达156

9．E.coli细胞质中目标蛋白的表达157

10．E.coli中外源蛋白质表达的分析157

11．在自身诱导培养基中小规模表达培养160

12．蛋白质的细胞质表达160

13．E.coli中细胞质目标蛋白的表达161

14．小规模渗透压休克的操作162

15．表达外源蛋白质的其他细菌体164

16．其他载体和诱导条件165

17．生产规模166

致谢166

参考文献166

13．毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达169

1．引言170

2．其他真菌表达系统170

3．培养基和细菌操作技术171

4．基因工程菌的构建172

5．基因的准备和载体的选择174

6．电穿孔转化176

7．DNA制备176

8．重组蛋白质生产菌株的检查178

9．进一步分析——Yeastern印迹182

10．重组蛋白质翻译后修饰（蛋白酶作用和糖基化）184

11．表达暗盒多重拷贝的选择185

参考文献187

14．杆状病毒——昆虫细胞表达系统191

1．引言192

2．杆状病毒生物学和分子生物学的简述193

3．杆状病毒表达载体195

4．杆状病毒表达载体技术——初期阶段196

5．杆状病毒表达载体技术——后期阶段198

6．杆状病毒转移质粒的修饰198

7．亲代杆状病毒基因组的修饰200

8．杆状病毒的另外一半——昆虫细胞系统210

9．杆状病毒表达载体的新一代昆虫细胞宿主212

10．杆状病毒基本操作规程214

参考文献218

15．瞬间基因转移到哺乳动物细胞实现对重组蛋白质的生产223

1．引言224

2．常用于TGE方法中的HEK293和CHO细胞系224

3．HEK293和CHO细胞的表达载体226

4．悬浮液中HEK293和CHO细胞系的培养228

5．转染方法228

6．结论234

致谢234

参考文献235

16．蛋白质表达的标签239

1．引言240

2．设计融合标签蛋白时考虑的因素241

3．蛋白质亲和标签245

4．促溶蛋白标签249

5．蛋白标签的去除251

6．结论253

致谢254

参考文献254

17．可溶性包含体蛋白质的重折叠259

1．引言260

2．常见的重折叠因素262

3．常规步骤262

4．常规操作规程263

5．对操作流程的评价264

6．蛋白质重折叠的测试筛选271

7．其他的重折叠步骤275

8．重折叠数据库：重折叠277

9．增加可溶蛋白质比例的策略277

10．结论279

参考文献279

第四部分 提取物和亚细胞组分的分离279

18．生物提取物制备的研究进展——用于蛋白质纯化285

1．引言286

2．化学法和酶法破碎细胞287

3．机械法破碎细胞290

4．结束语293

5．细胞破碎的步骤、试剂和注意事项293

参考文献301

19．亚细胞器官的分离和结构305

1．引言306

2．亚细胞蛋白质组的提取和初步分离308

参考文献327

第五部分 纯化步骤：批量法327

20．蛋白质沉淀技术331

1．引言332

2．硫酸铵沉淀332

3．聚乙烯亚胺沉淀337

4．其他方法341

5．沉淀法分离蛋白质的常规操作341

参考文献342

21．用于去除核酸的Affi-Gel蓝胶和核苷酸结合蛋白质的初步富集343

1．代表性的操作规程344

参考文献345

第六部分 纯化步骤：层析法345

22．离子交换层析349

1．引言349

2．原理351

3．固定相353

4．结合条件355

5．洗脱条件361

6．离子交换柱的操作363

7．例子：复合蛋白质混合物的分离366

8．例子：整体柱的高分辨率分离367

参考文献370

23．凝胶过滤373

1．原理373

2．操作374

24．羟磷灰石柱用于蛋白质层析387

1．引言388

2．机理389

3．化学特性392

4．纯化操作规程396

5．制备实验室用的柱子397

6．制备工业规模的柱子399

7．应用401

参考文献402

25．疏水层析（HIC）在蛋白质纯化中的理论和应用405

1．理论406

2．HIC吸附剂的最新技术408

3．使用HIC吸附剂的步骤409

参考文献413

第七部分 纯化步骤：亲和法413

26．亲和层析柱：常规方法417

1．引言418

2．亲和基质的选择419

3．配基的选择423

4．化学吸附429

5．纯化方法433

参考文献435

27．固定化金属亲和层析（IMAC）：综述439

1．IMAC配基和固相离子的概述440

2．IMAC的应用444

3．结论467

致谢468

参考文献468

28．多羟基反应单克隆抗体的鉴定、生产和应用——用于免疫亲和层析475

1．引言476

2．多羟基反应单克隆抗体477

3．结论492

公告493

参考文献493

第八部分 纯化步骤：电泳法493

29．单向凝胶电泳497

1．背景498

2．聚丙烯酰胺凝胶500

3．方法的原理501

4．步骤502

5．凝胶中蛋白质的检测508

6．标准蛋白质510

7．分子量的测定511

8．制备电泳511

参考文献513

30．等电聚焦和双向凝胶电泳515

1．引言516

2．材料527

3．方法528

参考文献538

31．蛋白质凝胶染色方法：引言和综述541

1．引言542

2．常规考虑543

3．仪器：检测和记录545

4．总蛋白质检测545

5．磷蛋白质的检测556

6．糖蛋白质的检测557

参考文献559

32．凝胶中蛋白质的洗脱565

1．引言565

2．通过扩散来洗脱凝胶中的蛋白质566

3．反相HPLC取代SDS凝胶570

4．电泳洗脱570

5．结论571

参考文献571

33．着重于化学发光检测对蛋白质印记进行优化573

1．蛋白质印迹574

2．蛋白质印迹的种类575

3．检测方法579

4．化学发光信号583

5．常见问题及其原因588

6．使用化学发光底物的印迹和操作规程的优化593

参考文献598

第九部分 膜蛋白和糖蛋白的纯化程序598

34．去污剂：综述603

1．引言604

2．去污剂结构604

3．溶液中去污剂的性质605

4．利用去污剂的物理化学参数进行膜蛋白质的纯化612

5．去污剂的去除及交换613

6．选择合适的去污剂613

7．结论615

致谢616

参考文献616

35．膜蛋白质的纯化619

1．引言619

2．膜的制备620

3．天然膜蛋白的溶解622

4．膜蛋白质的纯化625

5．去污剂的去除及交换628

6．重组整合膜蛋白质的表达和纯化628

参考文献629

36．重组G蛋白质偶联受体的纯化631

1．引言632

2．蛋白质增溶的一般注意事项633

3．蛋白质纯化的一般注意事项634

4．重组神经降压素受体NTS1的增溶及纯化637

5．纯化蛋白质NTS1的分析641

6．结论642

致谢642

参考文献642

37．整合膜蛋白在单室脂质体中的无细胞翻译647

1．引言648

2．无细胞翻译的概述650

3．表达载体651

4．基因克隆652

5．PCR产物的清除655

6．Flexi载体和PCR产物的消化反应656

7．连接反应657

8．转化反应658

9．质粒DNA的纯化659

10．mRNA的制备660

11．脂质体的制备661

12．小麦胚芽翻译的反应662

13．密度梯度超速离心法进行纯化665

14．脂蛋白体的特点667

15．规模化纯化的注意事项669

16．同位素标记进行结构研究669

17．结论670

致谢670

参考文献670

第十部分 纯化蛋白质的特性670

38．蛋白质纯度测定677

1．蛋白质的组成和活性分析680

2．电泳法681

3．色谱法685

4．沉降速度测定法687

5．质谱法687

6．光散射法688

参考文献689

39．蛋白质亚基的存在及其大小和分子量的测定691

1．引言692

2．化学方法695

3．传输方法698

4．散射方法716

5．蛋白质亚基的存在719

参考文献721

40．翻译后修饰蛋白质的定性与定量725

1．引言726

2．用于鉴定PTMs的富集技术731

3．硝化蛋白的修饰740

4．甲基化和乙酰化741

5．质谱分析744

6．CID、ECD和ETD的对比747

7．PTMs的定量分析750

8．展望756

致谢758

参考文献758

第十一部分 其他技术758

41．表达和纯化相应的方法767

1．引言767

2．基于终端使用的策略768

3．构建表达结构的平行克隆策略771

4．用于鉴别合适结构的小规模表达筛选774

5．分析检测蛋白质以进行筛选778

6．大规模平行表达780

7．结论783

致谢783

参考文献784

42．氧敏感蛋白的分离技术：以［4FE-4S］-FNR为例787

1．引言788

2．4FE-FNR的厌氧分离790

3．含FNR的［4FE-4S］2＋族蛋白质的特征799

4．总结803

参考文献803

第十二部分 结束语803

43．纯化程序的再思考809

1．引言809

44．蛋白质生物化学中重要的却鲜为人知（或易被忽视）的几点813

1．引言814

2．SDS凝胶电泳的样品制备814

3．缓冲液816

4．色谱817

5．过滤过程中的蛋白质吸收818

6．塑料制品中的化学物浸出819

7．尿素中的氰酸盐819

参考文献820

撰稿人索引821

索引835