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第一篇 酶学篇2

第一章 基因工程核酸酶简介2

第一节 基因工程核酸酶概况2

第二节 基因工程核酸酶2

一、锌指核酸酶2

二、归巢核酸酶6

三、TALE核酸酶7

四、CRISPR/Cas13

五、三种核酸酶在基因治疗领域的比较18

第二章 归巢内切酶21

第一节 归巢内切酶概况21

第二节 归巢内切酶22

一、归巢内切酶家族22

二、归巢内切酶剪切机制23

三、归巢内切酶克隆与组装25

四、归巢内切酶在基因操作和重组中的应用研究27

第三章 利用锌指核酸酶技术的基因治疗研究进展30

第一节 锌指核酸酶概况30

第二节 ZFN作用原理31

第三节 ZFN的应用和限制33

第四节 ZFN构建的技术改进36

一、ZFP结合域技术改进37

二、报告、筛选系统改进40

三、Fok Ⅰ切割结构域技术改进41

四、ZFN定点修饰技术改进42

五、ZFN转染细胞技术改进43

六、脱靶位点检测改进44

第四章 TALE文库构建与TALENs相关基因治疗研究48

第一节 TALENs简介及研究背景48

一、TALENs简介48

二、TALENs的基因治疗作用50

三、TALENs的应用价值53

第二节 国内外研究现状和发展趋势54

一、遗传病基因治疗的现状和发展趋势54

二、基因剪辑的现状和发展趋势57

三、TALENs克隆及基因剪辑效率和特异性研究现状与发展趋势59

四、TALENs的应用研究进展和趋势60

第五章 反因子核酸酶的设计与组装63

第一节 TALE密码、晶体结构与应用64

一、TALE密码64

二、TALE晶体结构66

三、TALE的应用66

第二节 TALENs靶点的设计和合成方法67

一、TALENs靶点的设计67

二、TALENs组装构建方法70

第六章 反因子核酸酶活性检测81

第一节 luciferase SSA法81

第二节 细胞内源基因突变率检测法86

一、非配对内切酶法-T7E1法或Cel Ⅰ法86

二、限制性内切酶法88

第三节 融合荧光法89

第四节 原核蓝/白与白/蓝系统法90

第七章 高通量测序技术在反因子核酸酶酶活性与脱靶效应检测中的应用93

第一节 反因子核酸酶概况93

第二节 反因子核酸酶活性与脱靶效应检测94

一、反因子核酸酶的构建与表达94

二、反因子核酸酶作用后的突变分析94

三、高通量测序技术在反因子核酸酶活性与脱靶效应检测中的优越性101

第二篇 技术篇104

第八章 反向遗传学在斑马鱼研究中的应用104

第一节 反向遗传学在斑马鱼研究中的技术概况104

第二节 靶基因的筛选105

第三节 MO基因敲降106

第四节 反向遗传工具的基因组大范围筛选108

一、反转录病毒插入108

二、TILLING108

第五节 ZFN109

第六节 TALEN——最具前景的反向遗传学工具110

一、TALE的组成111

二、TALEN靶位点的选择112

三、人工构建TALE重复序列的策略114

四、TALEN诱变的检测方法116

五、TALEN技术的应用118

六、TALEN技术的待解决问题120

第七节 CRISPR/Cas9系统121

一、CRISPR/Cas9的起源121

二、CRISPR/Cas9系统的工作原理121

三、CRISPR/Cas9系统的优点123

四、设计CRISPR/Cas9系统的原则以及操作事项124

五、CRISPR/Cas9系统的应用124

第八节 总结与展望125

第九章 反因子核酸酶（TALENs）在果蝇基因组修饰中的应用130

第一节 修饰果蝇基因组的常见技术130

一、转座元件介导的基因组突变130

二、同源重组介导的基因打靶132

三、phiC31定点整合酶介导的多重基因打靶134

四、锌指核酸酶介导的基因组修饰135

第二节 转录激活因子样效应蛋白的生物学性质136

第三节 TALENs介导的基因组操作技术在果蝇中的工作原理137

一、构建TALEs137

二、构建TALENs及其体外转录获得mRNAs139

三、可遗传突变的获得和插入缺失突变的分析140

第四节 TALENs在果蝇中的应用案例分析141

第五节 TALENs在果蝇中应用的优势和展望143

第十章 反因子核酸酶用于人类疾病模型的建立148

第一节 人类疾病模型简介148

第二节 应用反因子核酸酶建立人类疾病模型的优势151

第三节 应用反因子核酸酶建立人类疾病模型的实例（研究进展）153

第三篇 应用篇158

第十一章 基因治疗158

第一节 基因治疗的适应证158

一、遗传性疾病158

二、肿瘤159

三、病毒性感染疾病160

第二节 基因转移的基本方法160

一、质粒体DNA直接注射法161

二、脂质体介导的基因转移162

三、腺病毒与腺相关病毒作为基因转移的载体163

四、其他病毒载体165

第十二章 反因子核酸酶靶向编辑HER-2基因的可行性评价166

第一节 研究背景166

一、乳腺癌基因治疗研究的独特社会和生物医学价值166

二、HER-2作为乳腺癌基因治疗的生物靶标167

三、新型基因剪辑技术靶向剪切目标序列应用于乳腺癌基因治疗的可行性169

第二节 研究内容172

第三节 项目的特色与创新之处174

一、基因技术174

二、肿瘤治疗174

第四节 技术路线图174

第十三章 多模态成像监测EGFR基因特异性TALENs治疗非小细胞肺癌可行性研究178

第一节 肺癌治疗现状178

第二节 TALENs靶向EGFR基因治疗肺癌的实验方案179

第十四章 基因编辑技术敲除雄激素受体治疗前列腺癌的多模态成像评价189

第一节 前列腺癌治疗现状189

第二节 TALENs靶向雄激素受体基因治疗前列腺癌的实验方案192

第十五章 TALENs基于抗肌萎缩蛋白基因44号外显子缺失的基因治疗策略199

第一节 工程核酸酶TALENs在基因治疗中的潜力199

第二节 治疗障碍及DMD的临床特征202

第三节 多基因治疗策略：从DMD转变为BMD的可能性204

第十六章 反向基因治疗优势211

第一节 基因失活的价值212

第二节 未来的期望——治愈部分疾病213

第三节 反向基因组学与基因治疗214

附录一 CCR5与艾滋病的防治216

附件二 相关英文文献219