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第一章 microRNA概述1

第一节 microRNA的生物起源和生物合成2

1 microRNA的生物起源2

2 microRNA的生物合成2

第二节 microRNA的特征和命名5

1 microRNA的特征5

2 microRNA的命名6

第三节 microRNA的调控机制7

第四节 microRNA的功能8

1 miRNA在动物生长发育等方面的功能9

2 miRNA在植物生长发育等方面的功能10

第二章 microRNA的鉴定和表达分析策略15

第一节 microRNA的鉴定16

1 正向遗传学筛选法16

2 直接克隆法16

3 生物信息学预测法17

4 高通量测序法19

第二节 microRNA的表达分析策略21

1 microRNA的芯片分析21

2 microRNA的PAGE/Northern Blot分析33

3 microRNA的实时定量RT-PCR检测35

第三章 microRNA靶基因的分析策略39

第一节 microRNA候选靶基因的寻找40

1 microRNA候选靶基因的生物信息学预测40

2 寻找microRNA候选靶基因的生物学实验方法52

第二节 microRNA候选靶基因的生物学鉴定54

1 荧光定量PCR及Western blot法54

2 双荧光素酶报告基因法55

3 RLM-5＇RACE法55

4 降解组测序法57

第四章 microRNA的生物功能分析策略59

第一节 microRNA过量表达60

1 化学合成microRNA模拟物（microRNA mimics）60

2 构建microRNA过量表达载体61

第二节 microRNA减低表达63

1 化学合成microRNA抑制剂（microRNA inhibitor）63

2 靶基因模拟技术（target mimicry，TM）63

第三节 人工miRNA（artificial microRNA，amiRNA）69

第五章 microRNA165/166在植物中的功能研究71

第一节 植物microRNA165/166研究进展72

第二节 microRNA165/166在植物中的功能研究所用到的材料与方法75

1 植物材料和生长条件75

2 STTM165/166载体的构建及拟南芥和番茄的转化75

3 RNA提取、Northern blot和实时定量PCR分析77

4 组织学79

5 液质联用半定量法测定IAA含量80

6 花青素含量的测定80

第三节 STTM165/166过表达植株中miR-165/166及其靶基因的表达分析80

第四节 STTM165/166转基因拟南芥和番茄的表型特征82

1 STTM165/166转基因拟南芥幼苗的表型特征82

2 STTM165/166转基因拟南芥主茎、侧枝、花和果荚表型82

3 过表达STTM165/166对拟南芥叶片极性和茎维管组织结构的影响84

4 STTM165/166转基因番茄的表型变化86

第五节 STTM165/166对生长素生物合成和信号的调控87

第六节 STTM165/166对植物抗盐能力的影响91

第七节 STTM165/166对拟南芥花青素生物合成的影响94

第八节 miR-165/166介导的调控网络94

第六章 microRNA828调控番茄花青素生物合成的功能研究97

第一节 植物microRNA828研究进展98

第二节 microRNA828在番茄中的功能研究所用到材料与方法100

1 材料100

2 番茄植株缺磷胁迫处理方法及培育100

3 DNA和RNA的提取100

4 miR-828靶基因的预测和RLM-5＇RACE实验验证101

5 At-pri-miR-828原始转录本序列的获得及引物设计与PCR扩增101

6 PCR产物的纯化与测序102

7 克隆载体pOT2-At-pri-miR-828和植物表达载体pC2300-pOT2-At-pri-miR-828的构建102

8 农杆菌介导的叶盘法转化番茄102

9 转基因番茄植株的PCR鉴定102

10 实时荧光定量qRT-PCR分析103

11 花青素含量的测定103

第三节 miR-828基因的克隆、表达及其对番茄的遗传转化104

1 拟南芥At-pri-miR-828基因的克隆105

2 番茄Sly-pri-miR-828基因的克隆105

3 番茄Sly-miR-828的组织特异性表达105

4 番茄miR-828靶基因的预测及RLM-5＇RACE体外分子剪切鉴定105

5 miR-828过表达克隆载体、表达载体的构建与鉴定107

6 农杆菌介导pC2300-pOT2-pri-miR-828对番茄的遗传转化108

7 转基因番茄植株的PCR鉴定108

8 转基因番茄植株相关基因表达的实时荧光定量PCR分析109

9 转基因番茄植株的表型鉴定及花青素测定110

第四节 缺磷胁迫下miR-828过表达对番茄花青素生物合成的影响111

1 miR-828对缺磷胁迫的响应111

2 缺磷胁迫下野生型番茄幼苗的表型特征112

3 正常MS生长条件下野生型和miR-828过表达转基因番茄的表型特征112

4 缺磷胁迫下野生型和miR-828过表达转基因番茄植株的表型特征112

5 缺磷胁迫下野生型和miR-828过表达转基因番茄中miR-828及其靶基因的表达分析113

6 缺磷胁迫下野生型和miR-828过表达转基因番茄植株中花青素合成相关酶基因的表达分析114

7 缺磷胁迫下野生型和miR-828过表达转基因番茄植株中的花青素含量114

第七章 microRNA858调控的花青素生物合成117

第一节 植物microRNA858研究进展118

第二节 microRNA858在番茄中的功能研究所用到材料与方法119

1 植物材料和生长条件119

2 pC2300-pOT2-STTM858植物表达载体的构建119

3 RNA提取、cDNA合成及实时定量PCR分析119

4 miR-858靶基因的预测和RLM-5＇RACE实验验证122

5 农杆菌介导的叶盘法转化番茄122

6 转基因番茄植株的PCR鉴定122

7 花青素含量的测定122

第三节 miR-858在番茄花青素生物合成中的调控作用122

1 番茄Sly-miR-858的克隆122

2 番茄Sly-miR-858的保守性和序列分析123

3 番茄Sly-miR-858靶基因的预测及RLM-5＇RACE体外分子剪切鉴定123

4 Sly-miR-858靶基因Sly-myb-like氨基酸的多重序列比对和进化树分析126

5 Sly-miR-858及其靶基因Sly-myb-like在番茄不同组织中的表达127

6 Sly-miR-858减低表达载体STTM858的构建与番茄的遗传转化127

7 转基因番茄植株STTM858、内源miR-858及其靶基因的实时荧光定量PCR分析127

8 STTM858转基因番茄植株的表型分析及花青素含量测定129

9 STTM858过表达转基因番茄植株花青素合成相关酶基因的实时荧光定量PCR分析129

第八章 小麦干旱胁迫诱导基因TaCRT的功能及其对microRNA的表达调控133

第一节 钙网蛋白CRT研究进展134

第二节 小麦钙网蛋白TaCRT的功能研究所用到材料与方法135

1 植物材料和干旱胁迫实验136

2 TaCRT基因全长cDNA的克隆136

3 TaCRT的亚细胞定位137

4 Southem杂交印迹分析138

5 Northern杂交印迹分析138

6 半定量PCR138

7 pCAPE2-TaCRT表达载体的构建及烟草的转化139

8 Westem Blotting蛋白印迹分析140

9 TaCRT转基因烟草植株的抗旱性鉴定140

10 TaCRT转基因烟草植株的microRNA芯片表达谱141

第三节 TaCRT在干旱胁迫中的功能及其对microRNA的表达调控141

1 TaCRT的克隆141

2 TaCRT cDNA序列的结构特征分析141

3 TaCRT的Southem杂交分析142

4 TaCRT蛋白的亚细胞定位143

5 PEG诱导的干旱胁迫下小麦TaCRT基因的表达模式146

6 TaCRT转基因烟草植株的鉴定148

7 转基因烟草的抗旱性分析151

8 小麦干旱胁迫诱导基因TaCRT介导的microRNA表达调控154

第九章 植物逆境胁迫响应microRNA的研究157

第一节 植物逆境胁迫响应microRNA研究进展158

1 miRNA与低氮胁迫158

2 miRNA与低硫胁迫158

3 miRNA与低磷胁迫159

4 miRNA与铜胁迫160

5 miRNA与重金属胁迫160

6 miRNA与高盐胁迫160

7 miRNA与低温胁迫161

8 miRNA与干旱胁迫161

9 miRNA与植物病虫害胁迫162

10 miRNA与氧化胁迫163

11 miRNA与机械胁迫163

12 miRNA与UV-B辐射胁迫164

第二节 植物逆境胁迫响应microRNA研究所用到材料与方法165

1 植物材料和胁迫条件165

2 植物miRNA芯片的设计、PAGE/Northem Blot、实时荧光定量qRT-PCR分析165

3 miRNA基因启动子区的顺式作用元件分析165

第三节 miR-398在NaCl和ABA胁迫下木本植物杨树和草本植物拟南芥中的差异表达分析166

1 木本植物杨树在NaCl和ABA胁迫下的microRNAs表达谱分析166

2 ABA和NaCl胁迫处理动态调控杨树miR-398及其靶基因的表达169

3 杨树和拟南芥中miR-398及其靶基因对ABA和NaCl胁迫的响应不同172

第四节 UV-B胁迫下木本植物杨树的microRNAs表达谱分析174

1 杨树UV-B胁迫响应microRNAs表达谱分析174

2 UV-B胁迫响应miRNA的PAGE/Northem验证178

3 UV-B胁迫响应miRNA靶基因的功能分析179

4 UV-B胁迫响应miRNA靶基因的qRT-PCR分析180

5 UV-B胁迫响应miRNA基因的启动子元件分析182

6 UV-B胁迫响应miRNA介导的基因表达调控网络184

参考文献187

发表与本专著相关的论文217