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第一章 基因克隆技术概述1

第一节 基因克隆技术1

一、基因克隆技术的诞生和兴起1

上篇 技术篇1

二、基因克隆技术的特点与步骤3

第二节 基因克隆技术早期开创性研究成就5

第二章 基因克隆技术制药中常用的工具酶8

第一节 限制性核酸内切酶8

一、限制酶的发现8

二、限制酶的类型9

三、限制酶的命名10

四、Ⅱ型限制酶的特性10

五、DNA的单酶切与限制片段末端连接13

二、基因工程中常用的连接酶14

第二节 DNA连接酶14

一、DNA连接酶连接作用的特点14

三、DNA连接酶连接作用的分子机理15

第三节 DNA聚合酶16

一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ16

二、Klenow大片段酶18

三、T4噬菌体DNA聚合酶19

四、经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶19

五、TaqDNA聚合酶及AmpliTaqTMDNA聚合酶20

六、反转录酶20

第四节 DNA修饰酶21

一、末端脱氧核苷酸转移酶21

二、碱性磷酸酶21

一、S1核酸酶22

三、T4噬菌体多核苷酸激酶22

第五节 单链核酸内切酶22

二、Bal31核酸酶23

第六节 核酸外切酶24

一、核酸外切酶Ⅶ24

二、核酸外切酶Ⅲ24

三、λ核酸外切酶25

第三章 基因克隆技术制药常用质粒载体26

第一节 质粒概述26

第二节 质粒DNA分子的基本特性28

一、质粒的构型、特性与大小28

二、质粒DNA的复制29

三、质粒DNA的提取与纯化31

四、质粒DNA浓度和纯度的测定32

一、理想质粒需满足的条件33

第三节 主要质粒载体的改造和构建33

二、质粒载体发展阶段34

三、pBR322质粒载体35

四、pUC质粒载体38

五、其他重要的质粒载体41

第四章 基因克隆技术制药常用噬菌体载体43

第一节 λ噬菌体载体43

一、λ噬菌体的基本特性43

二、λ噬菌体基因组的结构与功能45

三、λ噬菌体载体的改造与构建46

四、常用的λ噬菌体载体49

五、改良型λ噬菌体载体52

一、黏粒载体的构建54

第二节 黏粒载体54

三、常用的黏粒载体55

二、黏粒载体的特点55

第三节 M13噬菌体载体57

一、M13噬菌体的基本特性57

二、M13噬菌体载体的构建58

三、M13噬菌体载体系列的优点61

第四节 噬菌粒载体61

一、pUC118和pUC119噬菌粒载体61

二、pBluescript噬菌粒载体62

第五节 哺乳动物细胞载体系统64

第五章 基因工程药物目的基因制取65

第一节 目的基因的化学合成65

一、构建基因文库法分离目的基因的基本步骤68

第二节 构建基因文库法分离目的基因68

二、真核基因组DNA文库的构建过程71

第三节 酶促合成法制取目的基因73

一、真核生物细胞中的mRNA73

二、从构建的cDNA文库中筛选目的cDNA74

三、RT-PCR法合成目的cDNA79

第六章 目的基因与克隆载体的体外重组83

第一节 目的基因与质粒载体的连接83

一、黏性末端连接法83

二、定向克隆法85

三、平末端连接法87

四、同聚物加尾法88

五、加人工接头连接法90

七、其他转换末端形式连接法91

六、加DNA衔接物连接法91

第二节 目的基因与λ噬菌体载体的连接93

一、λ噬菌体载体臂DNA的制备93

二、λ噬菌体载体臂与目的DNA片段的连接94

第七章 重组克隆载体引入受体细胞95

第一节 受体细胞概述95

一、基因克隆的受体细胞95

二、重组体分子导入受体细胞的途径96

第二节 重组体DNA分子的转化或转染97

一、用氯化钙制备新鲜的感受态细胞转化法97

二、用复合剂制备感受态细胞转化法98

三、高压电穿孔转化法99

第三节 重组λ噬菌体DNA的体外包装与转导99

二、λ噬菌体DNA的体外包装100

一、λ噬菌体体外包装的基本原理100

三、包装提取物的制备101

四、重组λDNA的体外包装与感染方法101

第四节 重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染102

第八章 目的重组克隆的筛选、鉴定与分析104

第一节 含目的基因重组克隆的筛选104

一、抗生素抗性基因插入失活法104

二、β-半乳糖苷酶基因插入失活法105

三、快速细胞破碎与凝胶电泳筛选法105

四、放射性标记核酸探针杂交筛选法106

五、免疫化学筛选法112

第二节 目的重组克隆的鉴定114

一、酶切及凝胶电泳鉴定法114

二、Southern印迹杂交法116

四、电镜R-环检测法117

三、Northern印迹法117

五、免疫学检测法118

六、基因产物鉴定法121

第三节 重组DNA的序列分析121

一、Sanger双脱氧链终止法DNA测序122

二、Maxam-Gilbert化学修饰法DNA测序125

三、快速自动化DNA测序126

第九章 目的基因在宿主细胞中的表达127

第一节 外源目的基因在原核细胞中的表达127

一、原核基因表达载体的构成127

二、常见的原核细胞表达载体系统131

三、外源目的基因在原核细胞中的表达形式132

四、在原核细胞中高效表达目的基因134

五、基因定点诱变技术136

第二节 外源目的基因在真核细胞中的表达139

一、真核细胞表达载体的功能元件139

二、酵母菌表达系统141

三、昆虫细胞表达系统145

四、哺乳动物细胞表达系统146

下篇 应用篇151

第十章 基因克隆技术制药概述151

第一节 基因克隆技术的应用与发展趋势152

一、全球性的基因工程争夺战152

二、蛋白质工程的研究开发飞速发展153

三、转基因动植物生产药物的研究迅速崛起154

五、基因治疗技术取得重大进展155

六、国际“人类基因组计划”提前完成155

四、医学科学研究取得巨大成就155

第二节 基因克隆技术与生物制药157

一、基因克隆技术制药发展态势157

二、主要基因工程药物简介158

第十一章 生物药物基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达163

第一节 人白细胞介素基因的克隆与表达163

一、人白细胞介素-2融合蛋白工程菌的组建163

二、人白细胞介素-11的克隆及其融合蛋白表达164

第二节 集落刺激因子基因的克隆与表达167

一、GM-CSF重组表达载体与工程菌的组建167

二、GM-CSF/IL-3融合蛋白基因的克隆与表达167

第三节 纤溶酶原激活剂基因的克隆与表达170

第四节 碱性成纤维细胞生长因子基因的克隆与表达171

一、hIGF-Ⅰ在大肠杆菌蛋白酶缺陷株中的可溶性表达175

第五节 胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的克隆与表达175

二、重组高效表达载体的构建及rhIGF-Ⅰ的可溶性表达177

第六节 纳豆激酶基因的克隆及其表达178

第七节 人血管生成素基因的克隆及其表达182

一、人血管生成素cDNA的克隆与融合表达182

二、人血管生成素-PE40融合蛋白基因的克隆及表达184

第八节 单链抗体-γ干扰素基因的克隆与表达186

第十二章 生物药物基因的克隆及其在酵母菌中的表达188

第一节 纳豆激酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达188

第二节 双功能抗体基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达192

第十三章 生物药物基因的克隆及其在昆虫中的表达194

第一节 红细胞生成素基因的克隆及在家蚕体中的表达194

第二节 人白细胞介素-12基因的克隆及在昆虫细胞中的表达196

第十四章 生物药物基因的克隆及其在动物细胞中的表达200

第一节 红细胞生成素的克隆及其在CHO-dhfr-细胞中的表达200

第二节 bFGF基因的克隆及在成纤维和成骨细胞中的表达202

第三节 tPA突变体基因的克隆及其在CHO细胞中的表达204

第四节 以细胞因子重组质粒为佐剂的乙肝DNA疫苗的克隆及在COS-细胞表达205

第五节 乙型肝炎表面抗原preS2SDNA疫苗的克隆及其在COS-1细胞表达210

第六节 融合HBcAg基因和IL-2基因DNA疫苗的克隆及其在COS-7细胞表达211

第十五章 基因工程菌和工程细胞的培养与发酵215

第一节 基因工程细菌的培养与发酵215

一、rhANG基因工程菌发酵条件的研究215

二、治疗型乙型肝炎病毒DNA疫苗工程菌的培养与发酵生产217

三、重组大肠杆菌的高密度发酵技术220

第二节 基因工程酵母的培养与发酵221

一、工程酵母表达HBscFv-IFNγ的发酵工艺优化221

二、重组酵母表达纳豆激酶最佳发酵条件研究223

三、基因工程酵母菌的高密度发酵226

第三节 工程细胞的培养与发酵227

第一节 影响分离纯化工艺设计的主要因素229

第十六章 基因工程药物的分离纯化229

第二节 各种产物表达形式采用的分离纯化方法230

一、细胞内不溶性表达产物——包涵体230

二、分泌型的表达产物231

三、大肠杆菌细胞内可溶性表达产物232

四、大肠杆菌细胞周质表达蛋白232

第三节 基因工程药物的分离纯化实例232

一、以包涵体形式表达的rGM-CSF中试分离纯化232

二、重组人血管生长素包涵体的分离纯化234

三、以分泌型表达的人α1干扰素的分离纯化236

四、以可溶性形式表达的rhG-CSF的分离纯化237

五、在酵母中表达的HBsAg的分离纯化237

六、在酵母中表达HBscFv-IFNγ融合蛋白的分离纯化238

二、基因工程药物的特点241

一、主要的基因工程药物241

第十七章 基因工程药物的分析与检验241

第一节 基因工程药物的质量控制241

三、基因工程药物的质量要求242

四、基因工程药物的质控要点243

五、基因工程药物的制造及检定规程247

第二节 基因工程药物常用的检验方法248

一、化学检定法248

二、肽图分析法248

三、外源性DNA残留量的测定249

四、宿主细胞蛋白杂质的检测250

五、无菌试验252

六、内毒素试验254

七、异常毒性试验255

八、热原质试验256

九、生物学活性（效价）检定257

第三节 基因工程药物的分析检验举例257

一、重组人干扰素的分析检验257

二、重组人白细胞介素的分析检验258

三、重组人红细胞生成素的分析检验259

四、重组人集落刺激因子的检验261

附录1 干扰素效价测定（细胞病变抑制法）263

附录2 重组人白细胞介素-2效价测定（CTLL-2依赖细胞株／MTT比色法）265

附录3 EPO体内活性测定（网织红细胞法）266

附录4 EPO纯度测定（HPLC-SEC法）267

附录5 CHO细胞蛋白残留量测定（ELISA法）268

附录6 rhG-CSF效价测定（NFS-60依赖株／MTT比色法）269

主要参考文献270