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绪论1

第1章 基因与基因工程13

1.1 基因13

1.1.1 基因的基本结构特征14

1.1.2 基因表达调控17

1.1.3 基因打靶与基因沉默33

1.2 基因工程35

1.2.1 基因工程定义36

1.2.2 基因工程工具酶36

1.2.3 基因克隆载体38

1.2.4 基因工程基本操作步骤52

1.2.5 基因工程历史54

1.2.6 基因工程应用55

第2章 动物克隆技术和理论63

2.1 动物克隆技术发展简介63

2.1.1 动物胚胎分割技术63

2.1.2 动物细胞核移植技术64

2.2 动物克隆技术的基本原理66

2.2.1 胚胎分割的基本原理66

2.2.2 细胞核移植的基本原理67

2.3 动物克隆技术67

2.3.1 显微操作器械67

2.3.2 胚胎分割68

2.3.3 细胞核移植69

2.4 动物克隆理论75

2.4.1 受体胞质对供体核的重编程76

2.4.2 核质互作81

2.4.3 核移植的线粒体问题81

2.4.4 哺乳动物的表观遗传学调控82

2.4.5 DNA甲基化与动物克隆87

2.4.6 基因组印记与动物克隆91

2.5 小结97

第3章 动物转基因技术98

3.1 动物转基因技术和克隆技术的区别98

3.2 动物转基因技术98

3.2.1 原核期胚胎的显微注射技术99

3.2.2 逆转录病毒载体侵染技术99

3.2.3 慢病毒载体技术100

3.2.4 精子载体技术101

3.2.5 体细胞核移植技术102

3.2.6 ES细胞介导技术105

3.2.7 胞内单精注射技术106

3.2.8 受体介导的基因转移106

3.3 动物转基因新技术研究进展107

3.3.1 PGCs技术107

3.3.2 精原干细胞法108

3.3.3 基因打靶技术108

3.3.4 RNA干扰（RNAi）介导的基因沉默技术113

3.3.5 诱导多能干细胞转基因技术114

3.3.6 人工染色体法116

3.3.7 双顺反子条件表达转基因系统法119

3.3.8 问题与展望119

3.4 外源重组基因导入动物细胞的其他方式121

3.4.1 电穿孔法121

3.4.2 基因枪法121

3.4.3 超声波法122

3.4.4 磷酸钙或DEAE-葡聚糖转染法122

3.4.5 脂质体介导转化法122

3.4.6 动物病毒介导转导法122

3.5 提高转基因效率的策略123

3.5.1 外源基因的整合机制123

3.5.2 转基因表达载体的构建126

3.6 转基因技术存在的问题130

3.6.1 成本高、整合效率总体比较低130

3.6.2 转基因表达水平低130

3.6.3 难以控制转基因在宿主基因组中的行为131

3.6.4 目的基因与动物生产性状的多基因矛盾突出131

3.6.5 转基因动物及其产品的安全性问题131

第4章 目的基因的分离133

4.1 核酸的制备134

4.1.1 DNA的制备134

4.1.2 RNA的制备135

4.1.3 人工合成核酸片段135

4.1.4 核酸样品的分析与检测136

4.2 基因文库的构建139

4.2.1 原核生物基因组文库的构建140

4.2.2 真核生物基因组文库的构建142

4.2.3 cDNA基因文库的构建146

4.3 目的基因的分离153

4.3.1 从基因文库中筛选分离目的基因153

4.3.2 利用聚合酶链反应技术扩增目的基因158

4.3.3 利用差示分析法分离目的基因克隆163

4.3.4 应用基因定位克隆技术分离筛选目的基因164

4.3.5 标签测序法分离目的基因165

4.3.6 基因的酶法合成168

第5章 转基因细胞的制备170

5.1 受体细胞的类型171

5.1.1 原核受体细胞171

5.1.2 丝状真菌受体细胞171

5.1.3 酵母受体细胞172

5.1.4 动物受体细胞172

5.2 重组基因导入原核受体细胞的主要途径174

5.2.1 转化174

5.2.2 转导174

5.2.3 转染175

5.2.4 电穿孔175

5.2.5 三亲本杂交176

5.3 重组基因导入动物受体细胞176

5.4 重组子筛选177

5.4.1 遗传表型直接筛选177

5.4.2 依赖于重组子结构特征分析筛选181

5.4.3 核酸分子杂交分析182

5.4.4 免疫化学分析检测191

5.4.5 PCR筛选法194

5.5 转基因细胞的检测195

5.5.1 目的基因的整合检测195

5.5.2 目的基因的表达检测197

5.5.3 其他检测201

5.5.4 转基因细胞的核型分析202

第6章 卵母细胞体外成熟204

6.1 卵母细胞发育生物学特性204

6.1.1 卵泡发育和排卵205

6.1.2 卵母细胞卵膜的发生发育207

6.1.3 卵泡细胞在卵母细胞发育中的作用207

6.1.4 卵母细胞发育及成熟过程中超微结构的变化207

6.2 卵母细胞体外成熟210

6.2.1 卵母细胞体外成熟培养概况211

6.2.2 卵母细胞成熟的机理211

6.2.3 卵母细胞成熟培养214

6.2.4 影响卵母细胞体外成熟的因素219

第7章 胚胎体外培养和冷冻保存225

7.1 胚胎体外培养225

7.1.1 简单化学限定培养液225

7.1.2 共同培养系统226

7.1.3 添加肽类生长因子的培养系统227

7.1.4 早期胚胎体外发育的影响因素228

7.2 胚胎冷冻保存230

7.2.1 胚胎冷冻保存的发展简史230

7.2.2 胚胎冷冻保存的意义232

7.2.3 胚胎冷冻的基本原理232

7.2.4 胚胎冷冻及解冻的基本方法238

7.2.5 胚胎冷冻效果的鉴定245

第8章 转基因克隆胚胎移植与附植247

8.1 胚胎移植247

8.1.1 胚胎移植概述247

8.1.2 转基因克隆胚胎移植的准备251

8.1.3 受体的同期发情253

8.1.4 转基因克隆胚胎移植257

8.2 附植262

8.2.1 胚泡迁移、定位和植入262

8.2.2 附植中的妊娠识别及其机理263

第9章 转基因动物的检测和安全性评价266

9.1 转基因动物的检测266

9.1.1 外源基因存在的检测266

9.1.2 外源基因拷贝数的检测266

9.1.3 外源基因整合位点数的检测268

9.1.4 外源基因整合位点基因组序列的检测268

9.1.5 转基因表达的检测269

9.1.6 转基因动物检测中存在的问题和展望270

9.2 转基因动物的安全性评价271

9.2.1 转基因动物安全性检测的内容和方式271

9.2.2 转基因动物研究及其产品的安全性评价273

9.2.3 转基因动物食品的安全性评价278

参考文献286