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第1章 重组蛋白分离与分析概论1

1.1 重组蛋白质概论1

目录1

1.2 重组蛋白质的设计及纯化技巧2

1.3 纯化目标5

1.3.1 产品的纯度和安全性5

1.3.2 终产物成本5

1.4 纯化策略6

1.5 纯化过程的放大7

1.7 合理设计纯化工艺8

1.6 对纯化的综合评价8

主要参考文献11

第2章 重组蛋白纯化的一般工艺及方法14

2.1 引言14

2.2 用做纯化的主要蛋白质性质14

2.2.1 蛋白质大小15

2.2.2 蛋白质形状15

2.2.3 蛋白质荷电性15

2.2.8 蛋白质与配体结合能力16

2.2.7 蛋白质密度16

2.2.9 蛋白质与金属螫合能力16

2.2.5 蛋白质疏水性16

2.2.4 蛋白质等电点16

2.2.6 蛋白质溶解度16

2.2.10 蛋白质的某些特殊性质17

2.3 纯化分离技术18

2.3.1 发酵液的预处理18

2.3.2 细胞分离技术20

2.3.3 细胞破碎技术24

2.3.4 生物物质的分离纯化技术24

2.4 纯化方案中纯化顺序的选择76

2.5 固定相的选择77

2.6 方案的有效性分析78

主要参考文献79

3.2 破碎率的评价81

第3章 细胞破碎的物理及化学方法81

3.1 前言81

3.3 破碎方法82

3.3.1 球磨匀浆法83

3.3.2 转子-定子式匀浆机匀浆87

3.3.3 高压匀浆机匀浆90

3.3.4 超声波破碎94

3.3.5 其他物理方法95

3.3.6 细胞自溶98

3.3.7 酶解法101

3.3.8 干燥法102

3.3.9 其他化学溶剂法103

3.3.11 通过细胞自身调控体系进行细胞的破碎104

3.4 总结104

主要参考文献106

4.1 天然及变性蛋白的水解108

4.1.1 蛋白酶的生化作用108

第4章 纯化过程中如何防止蛋白水解108

4.1.2 蛋白酶的种类和蛋白酶的作用机理109

4.1.3 蛋白酶的特异性及对降解底物的敏感性110

4.2 用作宿主细胞的真核、原核生物体内的蛋白酶111

4.2.1 大肠杆菌（E.coli）内的蛋白酶111

4.2.2 枯草杆菌（Bacillus subtilis）产生的蛋白酶112

4.2.3 酵母中的蛋白酶113

4.2.4 哺乳动物细胞内的蛋白酶115

4.3 蛋白酶的鉴定116

4.4 防止重组蛋白水解的策略117

4.4.1 基因调控法118

4.4.2 去除蛋白酶的策略121

4.4.3 抑制蛋白酶的策略122

主要参考文献125

5.1 引言127

5.1.1 蛋白质转译后的修饰及鉴定分析127

第5章 从重组蛋白质中除去N末端甲硫氨酸的方法127

5.1.2 甲硫氨酸氨基肽酶的特性131

5.1.3 胞质间重组蛋白的加工131

5.1.4 与多余甲硫氨酸相关的非均匀性和免疫原性132

5.2 去除末端甲硫氨酸的方法133

5.2.1 体内去除末端甲硫氨酸的方法133

5.2.2 去除末端甲硫氨酸的体外方法135

主要参考文献137

第6章 药用蛋白质的纯化141

6.1 引言141

6.2 蛋白质纯化过程中的质量控制142

6.2.1 蛋白质生物功效142

6.2.2 蛋白质结构143

6.2.3 蛋白质纯度的测定143

6.2.4 终产品中痕量杂质的分析143

6.3 蛋白质纯化准则143

6.3.1 初始原料物质的浓度和杂质性质144

6.3.2 非蛋白杂质的去除145

6.3.3 DNA的去除145

6.3.4 热源的去除147

6.3.5 病毒的去除149

6.3.6 外源蛋白的去除150

6.4 方案的有效性151

6.5 结论152

主要参考文献153

第7章 利用工程修饰改进重组蛋白的纯化分离157

7.1 引言157

7.2 引入切割位点的重组工程蛋白158

7.3 促进活性蛋白分离的工程技术159

7.3.1 形成包涵体以稳定蛋白质160

7.3.2 基团修饰以利天然活性蛋白质生产162

7.4 简化纯化工艺的蛋白质工程163

7.4.1 改进色谱性能的蛋白质工程164

7.4.2 构建工程位点使蛋白质具有免疫亲和性能164

7.4.3 构建工程位点使蛋白质具有离子交换吸附性能166

7.4.4 构建工程位点使蛋白质具有金属亲和吸附性能168

7.4.5 低成本纯化蛋白工程171

7.4.6 改进分析方法的蛋白质工程171

7.5 结论172

主要参考文献173

第8章 大肠杆菌表达的重组蛋白的分离纯化175

8.1 引言175

8.2 大肠杆菌表达的分泌型重组蛋白的纯化分离178

8.2.1 纯化方法179

8.2.2 实例180

3.3.10 细胞渗透法193

8.2.3 分泌型重组蛋白的纯化分离总结199

8.3 大肠杆菌表达的包涵体蛋白的纯化分离200

8.3.1 确定包涵体量201

8.3.2 重组蛋白稳定性检测204

8.3.3 纯化方案206

8.3.4 包涵体的组成分析210

8.3.5 包涵体的结构214

8.3.6 影响包涵体形成的因素214

8.3.7 包涵体蛋白纯化实例216

8.3.8 包涵体蛋白纯化总结221

主要参考文献221

第9章 酵母表达的重组蛋白的分离纯化225

9.1 引论225

9.2 酿酒酵母或面包酵母表达的重组蛋白的分离纯化227

9.2.1 酿酒酵母或面包酵母表达的胞内蛋白质的分离纯化228

9.2.2 酿酒酵母或面包酵母分泌表达的蛋白质的分离纯化232

9.2.3 结论234

9.3.1 背景235

9.2.4 酿酒酵母或面包酵母表达的重组蛋白的研究展望235

9.3 Pichia pastoris生产的重组蛋白的分离纯化235

9.3.2 Pichia pastoris表达体系的发展236

9.3.3 P.pastoris表达的胞内外源蛋白239

9.3.4 Pichia pastoris分泌的外源蛋白的分离纯化242

9.3.5 讨论248

主要参考文献249

第10章 单克隆抗体的纯化252

10.1 引言252

10.2 单克隆抗体制备过程253

10.3 抗体的物理特征257

10.4 单克隆抗体纯化工艺258

10.4.1 澄清258

10.4.2 沉淀260

10.4.3 分离260

10.4.4 非蛋白杂质的去除271

附录 鼠源性病毒检测273

主要参考文献274