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1 了解蛋白质相互作用的意义1

详细说明1

背景3

参考文献4

2 信号转导和哺乳动物细胞生长：问题及范例5

前言5

信号转导框架6

蛋白质—蛋白质相互作用和信号转导交叉点的调控8

信号转导和技术——对未来的一种看法8

参考文献9

3 蛋白质相互作用技术对肿瘤生物学与药物遗传学的影响12

序列变异：肿瘤易感性及基于遗传特异型蛋白相互作用的肿瘤治疗12

遗传危险因子13

肿瘤与基因组13

癌基因15

原癌基因15

抑癌基因16

DNA修复基因17

药物遗传学：当前的状态与未来的目标20

抗肿瘤治疗的反应21

运用蛋白质相互作用研究手段去分析遗传变异的功能意义22

标签融合蛋白22

免疫共沉淀22

酵母双杂交24

荧光共振能量转移技术24

表面等离子共振技术25

原子力显微镜技术25

参考文献26

结论26

前言32

4 用GST融合蛋白鉴定蛋白质—蛋白质相互作用32

Far western印迹和pull-down技术的优点33

替代方法，类似范例33

程序纲要33

Far western印迹分析33

GST沉降分析35

方案37

方案1：GST融合蛋白的制备37

方案2：Far western印迹：标记GST融合蛋白40

方案3：Far western印迹：探测膜41

方案4：GST沉降43

参考文献45

前言47

5 通过免疫共沉淀法鉴定相互作用蛋白质47

已知蛋白质间相互作用的检测48

新蛋白质间相互作用的鉴定48

程序纲要48

细胞裂解与免疫沉淀49

缔合蛋白的检测49

优化与对照50

蛋白质鉴定51

方案54

方案1：pVHL结合蛋白Cul2的鉴定54

致谢56

参考文献56

前言60

6 化学交联技术在研究蛋白质相互作用中的应用60

体内与体外交联反应的区别61

交联的步骤62

蛋白质作为交联反应物的作用62

pH的影响63

交联剂的类型63

交联的特异性及选择性65

交联的特异性及间距（分子标尺及近邻法）66

一般步骤66

交联蛋白的纯化及检测68

可裂变交联剂69

标记的交联剂69

高效液相色谱（HPLC）法分析肽图谱70

质谱法肽制图70

交联残基的鉴定70

亲和检测及交联蛋白的纯化70

交联多肽的亲和纯化71

参考文献71

7 研究蛋白质—蛋白质相互作用的酵母和细菌双杂交筛选系统74

前言74

方案75

第一部分：一种基于转录激活的酵母双杂交系统75

第二部分：一种基于转录激活的细菌双杂交系统95

致谢111

参考文献111

8 利用噬菌体展示技术研究蛋白质—蛋白质相互作用113

前言113

噬菌体展示技术的生物学概论115

程序纲要115

噬菌体展示技术潜在的局限性116

关于设计噬菌体展示文库方法的考虑117

噬菌体展示技术和模建结构域118

方案120

方案1：变异结构域文库的制备120

致谢130

参考文献131

9 在出芽酵母中鉴定蛋白质—蛋白质相互作用的遗传学策略135

前言135

为什么使用遗传方法136

程序纲要137

抑制基因搜寻的准备137

抑制基因搜寻的实施139

抑制基因的分析140

异源体系141

方案141

方案1：诱变141

方案2：酵母菌总DNA的制备142

方案3：酵母菌的转化143

参考文献143

10 研究蛋白质相互作用的FRET显微成像技术145

前言146

GFP：对分子和细胞生物学的影响及在蛋白质相互作用研究中的应用146

荧光共振能量转移146

程序纲要149

FRET检测方法149

受激发射过程测定149

频率域FLIM数据分析154

方案155

方案1：FRET实验155

致谢170

参考文献171

11 绿色荧光蛋白邻近成像法（GFP-PRIM）检测同型蛋白质间相互作用174

前言174

FRET检测同型蛋白质间相互作用175

GFP-PRIM检测同型蛋白质间相互作用175

PRIM与FRET的差异176

方案176

方案1：体外GFP-PRIM：荧光分光光度法测量激发比率176

方案2：活细胞GFP-PRIM：同型蛋白质相互作用成像179

结论181

参考文献182

12 质谱表征多元蛋白质复合物183

前言183

两个复合物研究例子的背景介绍184

程序纲要185

制样与样品导入185

单个蛋白质及其复合物的质谱186

单个蛋白质及其复合物的电荷状态188

复合物中亚基的排布189

蛋白质复合物的热稳定性探测189

多元蛋白质复合物的实时组装190

方案191

方案1：质谱表征多元蛋白质复合物191

展望191

参考文献192

13 用原子力显微技术检测配体—受体间相互作用194

前言194

程序纲要196

AFM仪器196

AFM在配体—受体相互作用研究方面的应用197

方案198

方案1：悬臂功能基化198

方案2：固定于琼脂糖珠上的配体的AFM检测199

方案3：活细胞上的AFM测定200

致谢202

参考文献202

前言205

14 Biacore表面等离子体共振分析相互作用的蛋白质205

程序纲要206

传感器芯片206

芯片表面的再生208

数据采集208

动力学检测209

浓度测定210

设计方案210

方案211

方案1：Biacore表面等离子体共振使用211

参考文献219

15 石英晶体微平衡生物传感器在蛋白质相互作用分析中的应用221

前言221

程序纲要223

方案1：石英晶体微平衡分析224

方案224

参考文献228

16 蛋白酶足迹法230

前言230

优点与局限231

蛋白质水解的类型233

其他方法234

程序纲要235

末端标记235

复合物的组装237

蛋白质水解238

断裂位点的鉴定240

定量分析240

方案1：利用蛋白激酶A进行末端标记241

方案241

方案2：铁－EDTA蛋白酶足迹法反应242

方案3：利用酶促蛋白酶进行蛋白质水解244

方案4：Tricine SDS－聚丙烯酰胺蛋白凝胶245

方案5：通过溴化氰断裂蛋白质所产生的校准梯形条带246

方案6：通过酶促断裂产生的校准梯形条带247

参考文献248

17 串联亲和纯化提高相互作用蛋白质的识别250

前言250

标签的选择与设计251

程序纲要253

构建表达TAP标签蛋白的细胞或生物体254

制备提取物254

串联亲和纯化255

方案1：制备用于纯化酵母Lsm3蛋白的提取物256

方案256

分析纯化后物质256

对照与确证256

方案2：利用TAP方法解析蛋白质相互作用257

参考文献260

18 逆转循环纯化蛋白质262

前言262

程序纲要264

总述264

融合蛋白的构建方案266

ELP标签和ITC条件的选择266

方案267

方案1：将ELP组分融合入靶蛋白267

方案2：从细胞裂解液中纯化ELP融合蛋白269

方案3：ELP融合蛋白的一般转移循环271

结论272

参考文献272

19 利用体外表达克隆鉴定相互作用蛋白质273

前言273

方案274

方案1：体外表达克隆274

参考文献280

20 用蟾蜍卵提取物修饰重组蛋白281

前言281

总则281

用细胞提取液作为模型系统282

蟾蜍卵提取物模型系统283

程序纲要283

蟾蜍卵提取物的制备284

重组蛋白的修饰和再分离285

修饰评价和修饰蛋白的利用286

对照288

方案289

方案1：卵提取289

方案2：修饰、再分离和评价291

方案3：质谱293

致谢294

参考文献294

21 采用λ阻遏物融合技术分离和鉴定自组装结构域297

前言297

程序纲要299

文库的构建300

挑选和筛选303

自组装结构域的鉴定305

寡聚化状态的检测305

方案306

方案1：λ阻遏物融合306

致谢310

参考文献311

22 基于膜的酵母双杂交体系314

前言314

酵母双杂交体系的局限性315

非传统的酵母双杂交体系——研究膜蛋白相互作用的工具315

筛选与NubG融合的cDNA库319

酵母S.cerevisiae膜蛋白相互作用的基因组范围的分析319

基于膜的酵母双杂交体系应用展望319

基于膜的酵母双杂交筛选与药物设计320

基于膜的酵母双杂交体系的优点和缺点320

致谢322

参考文献322

23 β－半乳糖苷酶互补实验对活细胞中蛋白质间相互作用的检测324

前言324

背景325

程序纲要327

构建和表达融合蛋白的策略327

检测β-gal活性的方法329

方案330

方案1：逆转录病毒的准备与靶细胞的转染330

方案2：化学发光法检测β-gal的活性331

方案3：流式细胞法检测β-gal的活性332

方案4：X-Gal实验检测β-gal的活性333

方案5：荧光－X-Gal实验检测β-gal的活性334

参考文献336

24 双杂交系统研究胞内蛋白质和单链抗体的相互作用338

前言338

应用酵母双杂交系统检测胞内单链抗体与抗原相互作用340

应用酵母双杂交系统筛选单链抗体文库342

双诱饵酵母双杂交系统一步法鉴定两种不同的单链抗体—抗原相互作用342

哺乳动物细胞双杂交系统评价单链抗体和蛋白质在胞内的相互作用345

程序纲要346

方案346

方案1：检测单链抗体—蛋白质相互作用的酵母双杂交系统346

方案2：哺乳动物细胞瞬时转染实验353

参考文献354

致谢354

25 利用蛋白质片段互补策略研究蛋白质相互作用和文库筛选357

前言357

程序纲要359

基本概念359

DHFR蛋白质片段互补分析（PCA）360

以新霉素和潮霉素B为基础的PCA362

TEM β－内酰胺酶PCA362

PCA研究的控制标准363

在细菌体内应用DHFR PCA方法库对库筛选相互作用的蛋白质363

方案365

方案1：细菌DHFR PCA存活分析365

方案2：在体内进行库对库的筛选相互作用蛋白质：细菌中进行代谢竞争选择365

方案3：哺乳动物细胞DHFR PCA存活分析366

方案4：哺乳动物细胞DHFR PCA荧光分析367

方案5：GFP PCA荧光分析369

方案6：体外β－内酰胺酶PCA比色分析370

方案7：体内β－内酰胺酶PCA酶活分析371

方案8：新霉素和潮霉素B存活分析373

参考文献374

26 基于cAMP信号级联的一种细菌双杂交系统376

前言376

以细菌腺苷酸环化酶为基础的双杂交系统原理377

程序纲要378

杂合蛋白的表达载体379

细菌菌株380

方案1：功能互补的数量测定381

方案381

筛选相互作用子381

试验细菌的转化381

选择表达相互作用杂合蛋白的细胞381

结论384

参考文献385

27 肽适配子与蛋白质功能和蛋白质网络系统研究387

前言387

肽适配子作为表型分析试剂388

应用酵母双杂交系统选取肽适配子389

双杂交系统中应用的随机肽库391

筛选随机肽库的双杂交策略393

肽适配子获取方法改进394

调节子和干扰子分析法396

竞选高效作用的肽适配子397

参考文献398

检验肽诱导表型的特异性398

结论398

28 用渐增截断方法产生蛋白质片段文库402

前言402

程序纲要403

基本概念403

渐增截断用载体的描述405

方案405

方案1：渐增截断405

结论414

参考文献414

29 蛋白质家族的新成员——催化抗体416

前言416

天然催化抗体417

人工抗体酶的设计和潜能417

抗体固有催化活性的质量控制标准419

高催化活性的天然抗体酶的分离420

抗体酶机制的研究421

结论422

参考文献422

30 通过核糖体展示进行蛋白质—配体相互作用的体外筛选和进化427

前言428

核糖体展示的原理428

核糖体展示的应用429

程序纲要430

用于核糖体展示的构建组分430

核糖体展示构建组分的制备431

用大肠杆菌S30细胞提取物进行体外翻译432

体外转录432

亲和筛选433

通过适应筛选压力剪切分子433

从筛选到进化434

DNA文库和单克隆的RIA分析434

核糖体展示的优化435

方案435

方案1：通过连接制备核糖体展示构建组分435

方案2：体外转录及mRNA的纯化437

方案3：大肠杆菌S30细胞提取物的制备439

方案4：体外翻译440

方案5：亲和筛选441

方案6：mRNA的纯化和RT-PCR443

方案7：进化：引入额外的多样性445

方案8：核糖体复合物与游离蛋白质及小分子化合物的分离446

方案9：放射免疫分析（RIA）446

方案10：Northern印迹447

参考文献448

31 用膜上肽合成的方法分析蛋白质相互作用451

前言451

相互作用研究的肽合成策略452

结合反应伴侣的检测453

程序纲要453

方案455

方案1455

参考文献459

前言461

32 蛋白成束增强蛋白质—蛋白质相互作用检测461

双杂交相互作用462

双杂交实验存在的问题462

蛋白成束对双杂交实验灵敏性的加强：应用于哺乳动物细胞462

杂交蛋白成束在双杂交实验中的优点464

程序纲要467

DNA结合结构域和DNA结合结构域融合蛋白467

激活结构域和激活结构域融合蛋白467

成束结构域468

报告基因和报告质粒468

细胞系468

对照469

方法469

致谢469

参考文献469

33 用计算方法分析全基因组蛋白质相互作用472

前言473

从基因组到后基因组473

发现全基因组蛋白质相互作用的问题473

软方法：纯计算475

种系发生谱475

基因簇477

基因融合477

中间方法：计算与实验478

代谢重组479

转录谱480

硬方法：纯实验480

注释（Curated）数据库480

文本挖掘481

生物学家的计算资源482

纯直系同源和种系发生谱483

基因共定位483

基因融合分析485

代谢网络和调控通路487

基因表达分析方法490

包含相互作用信息的数据库491

相互作用蛋白质数据库491

生物专业数据库491

参考文献492

34 蛋白质—蛋白质相互作用的可视化和整合496

前言497

为什么需要可视化497

蛋白质相互作用图与代谢途径498

蛋白质网络、蛋白质复合物和动态的蛋白质相互作用498

蛋白质—蛋白质相互作用和相关的信息499

可视化500

关系的可视化500

符号和规则503

图形和图形的绘制504

弹簧镶嵌体算法505

大型图形的局限性505

扩展到三维空间505

可视化技术505

利用补充数据整合蛋白质相互作用网络508

补充数据类型的同时显示508

实例：研究半乳糖代谢的整合网络508

信使RNA和蛋白质表达信息的添加引起的网络改变509

整合网络拓展了生物学的视野510

图形描述的选择512

从可视化描述到一个预测模型：利用物理相互作用网络来进行基因表达建模的早期步骤513

预测对半乳糖利用网络的某些扰动导致的表达变化513

将来研究方向514

参考文献515

35 通过调节蛋白质—蛋白质之间相互作用发展新的治疗方法518

前言518

靶向性转录518

可诱导的转录522

病毒载体的重定向524

总结525

参考文献525

附录1 注意事项531

附录2 供应商539

索引540