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第1章 绪论1

1.1 引言1

1.2 开始前应知道2

1.2.1 样品的性质2

1.2.2 分离的目的4

1.3 样品的预处理与检测5

1.4 建立分离6

1.4.1 选择HPLC分离模式与起始条件6

1.4.2 开始方法建立9

1.4.3 改善分离12

1.4.4 可重观的分离14

1.5 完善HPLC方法15

1.5.1 定量与方法论证15

1.5.2 解决出现的问题16

1.5.3 方法的普适性17

第2章 分离的基础21

2.1 引言21

2.2 分离度：总论21

2.2.1 分离度的测量23

2.2.2 最小的分离度25

2.3 分离度与各种条件的关系28

2.3.1 溶剂强度的影响30

2.3.2 选择性的影响33

2.3.2.1 改变流动相33

2.3.2.2 更换色谱性38

2.3.2.3 改变温度38

2.3.3 色谱柱理论板数的影响39

2.3.3.1 色谱柱的条件与分离42

2.3.3.3 柱外效应45

2.3.3.2 理论板数与各种条件的关系45

2.4 进样量的影响50

2.4.1 体积超载：样品体积对分离的影响50

2.4.2 质量超载：样品重量对分离的影响53

2.4.3 避免由于样品量太大引起的问题54

2.4.3.1 样品浓度太大54

2.4.3.2 痕量分析55

第3章 检测灵敏度与选择性59

3.1 引言59

3.2 UV检测60

3.2.1 总论60

3.2.2 波长的选择62

3.2.2.1 样品吸收值与其分结构的关系64

3.2.2.2 流动相吸收值与其组分的关系68

3.2.3 信号、噪音与检测精度71

3.2.4 提高信噪比，以获得更好的检测精度74

3.2.5 检测器的线性范围76

3.2.6 二极管阵列UV检测器77

3.3 其它HPLC检测器81

3.3.1 通用型检测器81

3.3.2 荧光检测器83

3.3.3 电化学检测器86

3.3.4 质谱检测（LC-MS）91

3.3.5 选择质谱检测器98

3.3.6 不常用类型检测器100

第4章 样品的制备105

4.1 引言105

4.2 样品的类型107

4.3.1 降低样品粒粒度113

4.3.2 干燥样品113

4.3 固体与半固体样品的预处理113

4.3.3 滤过115

4.4 液体样品的预处理115

4.4.1 液-液萃取（Liquid-Liquid Extraction, LLE）117

4.4.1.1 理论119

4.4.1.2 实践120

4.1.1.3 问题123

4.4.2 固相萃取（Solid-Phase Extraction, SPE）125

4.4.2.1 SPE与LLE125

4.4.2.2 SPE与HPLC126

4.4.2.3 SPE的应用126

4.4.2.4 SPE装置127

4.4.2.5 SPE仪器131

4.4.2.6 SPE方法建立132

4.4.2.7 用柱色谱预处理样品146

4.4.3 膜分离（Membrane Separations, MS）148

4.5 固体样品的预处理152

4.5.1 传统的萃取方法152

4.5.2 新型的萃取方法154

4.5.2.1 超临界流体萃取法（Supercritical Fluid Extraction, SFE）154

4.5.2.2 微波辅助溶剂萃取法（Microwave-Assisted Solvent Extraction, MASE）159

4.5.2.3 加速溶剂萃取法（Accelerated Solvent Extraction, ASE）162

4.5.3 固体萃取的方法比较163

4.6 柱切换163

4.6.1 操作原理163

4.6.2 建立一种柱切换方法：总的考虑169

4.6.3 以柱切换清除样品杂质的示例169

4.7 衍生化170

4.7.1 可检测性172

4.7.1.2 荧光检测174

4.7.1.1 UV检测174

4.7.2 柱前与柱后衍生化175

4.7.2.1 柱前衍生175

4.7.2.2 柱后衍生177

4.7.2.3 用衍生化进行手性分析178

第5章 色谱性185

5.1 引言185

5.2 色谱柱与柱填料的特性186

5.2.1 柱填料186

5.2.1.1 硅胶填充微粒188

5.2.1.2 多孔聚合物193

5.2.1.3 其它无机填料195

5.2.2 色谱性的构型197

5.2.3 固定相200

5.2.3.1 键合硅胶200

5.2.3.3 RPC中键合相的保留行为204

5.2.3.2 其它固定相204

5.2.4 保留值与选择性变化的原因216

5.3色谱柱的性能指标218

5.3.1 理论塔板数218

5.3.2 不对称与拖尾峰222

5.3.3 色谱柱失效：色谱柱寿命应有多长？223

5.3.4 保留值的重现性224

5.3.5 压力降224

5.3.6 键合相浓度（覆盖率）225

5.4 色谱柱问题与解决方案226

5.4.1 保留值与分离度重现性不好226

5.4.2 谱峰拖尾232

5.4.3 色谱柱寿命237

5.4.3.1 色谱柱滤板问题238

5.4.3.3 填充不良的色谱性239

5.4.3.2 强保留的样品组分239

5.4.3.4 压力影响240

5.4.3.5 化学影响240

5.4.3.6 其他因素240

5.4.4 方法建立推荐的色谱性243

第6章 中性样品：反相与正相HPLC（235）247

6.1 引言247

第一部分 反相色谱247

6.2 反相色谱的保留248

6.2.1 流动相的影响249

6.2.1.1 %B的选择250

6.2.1.2 流动相强度253

6.2.2 色谱柱和柱温的影响254

6.3.1 溶剂强度的选择性256

6.3 反相色谱的选择性256

6.3.2 溶剂类型的选择性259

6.3.3 柱类型的选择性262

6.3.4 温度的选择性264

6.4 反相色谱中非离子样品分离条件的优化266

6.4.1 开始266

6.4.2 优化选择性267

6.4.2.1 溶济强度（%B）的影响268

6.4.2.2 溶济类型与%B的影响268

6.4.2.3 混合有机溶剂的使用269

6.4.2.4 柱类型与%B的影响273

6.4.2.5 不同溶剂与柱类型的结合使用274

6.5 非水反相HPLC278

第二部分 正相色谱280

6.6.1 一般情况283

6.6.1.1 样品和溶剂的定位283

6.6 正相色谱的保留283

6.6.2 流动相的影响285

6.6.2.1 溶剂的强度285

6.7 正相色谱中非离子样品分离条件的优化285

6.6.2.2 流动相的选择性288

6.6.3 柱类型的影响290

6.6.4 温度的影响292

6.6.5 亲水样品的分离中水溶液流动相的应用293

6.7.1 初始条件295

6.7.1.1 色谱柱的选择297

6.7.1.2 流动相溶剂297

6.7.2 调整保留值298

6.7.3 优化选择性300

6.7.4 其它考虑302

6.7.4.1 缓缓柱平衡和溶剂分层302

6.7.4.2 固定相中水含量的变化303

第7章 离子样品：反相，离子对和离子交换HPLC309

7.1 引言309

7.2 酸性和碱性样品309

7.2.1 酸碱平衡与反相保留310

7.2.2 缓冲液的选择313

7.2.2.1 缓冲容量314

7.2.2.2 缓冲液的紫外吸收316

7.2.2.3 缓冲液的其它性质316

7.2.2.4 合适的缓冲液317

7.2.3 pKa与化合物结构的关系318

7.2.3.1 合适的流动相pH319

7.2.4 对于离子样品适宜的HPLC分离模式320

7.3 离子样品反相分离的优化320

7.3.1 初始实验320

7.3.2.1 pH321

7.3.2 选择性的控制321

7.3.2.3 溶剂类型324

7.3.2.2 溶剂强度（%B）324

7.3.2.4 柱温325

7.3.2.5 缓冲浓度326

7.3.2.6 胺改性剂326

7.3.2.7 柱型328

7.3.3 特殊问题328

7.3.3.1 pH敏感度328

7.3.3.2 硅羟基效应329

7.3.4 总结331

7.3.3.3 温度选择性331

7.4 离子对色谱334

7.4.1 保留机制334

7.4.1.1 pH和离子对337

7.4.1.2 离子对试剂的浓度337

7.4.1.3 离子对试剂的类型340

7.4.2 初始实验342

7.4.3 控制保留值范围和选择性：改变%B、pH离子对试剂浓度343

7.4.3.1 保留值范围345

7.4.3.2 选择性346

13.4.5 异常等温线行为348

7.4.4.1 溶剂强度（%B）350

7.4.4 其它因素对选择性变化的影响350

7.4.4.2 温度351

7.4.4.3 缓冲液浓度351

7.4.4.4 溶剂的类型351

7.4.4.5 缓冲液或添加盐的类型353

7.4.4.6 胺改性剂353

7.4.5 特殊问题355

7.4.5.1 人工峰356

7.4.5.2 柱平衡缓慢356

7.4.6 总结357

7.4.5.3 峰形较差357

7.5 离子交换色谱359

7.5.1 保留机制360

7.5.1.1 pH影响361

7.5.1.2 盐或缓冲液的类型361

7.5.2 方法建立362

7.5.3 混合模式分离（mixed-mode separation）362

7.5.1.4 柱型362

7.5.1.3 有机溶剂362

7.5.4 硅胶柱363

第8章 梯度洗脱369

8.1 引言369

8.2 梯度洗脱的应用370

8.2.1.1 样品的保留值范围372

8.2.1 梯度洗胶用于常规分析372

8.2.1.2 大分子样品组分374

8.2.1.3 晚流出组分374

8.2.1.5 稀样品溶液374

8.2.1.4 增强检测灵敏度374

8.2.1.6 梯度洗脱的替代法376

8.2.2 梯度洗脱用于方法建立377

8.2.2.1 用等度还是梯度分离377

8.2.2.2 估计最佳等度条件380

8.2.2.3 估计最佳梯度条件381

8.3 梯度洗脱的原理381

8.3.1 梯度与等度的原理383

8.3.2 梯度变化速率的影响385

8.3.3 梯度范围的影响387

8.3.4 梯度形状的影响389

8.3.4.1 同系物或低聚样品389

8.3.4.2 含组峰的色谱图391

8.4 建立梯度分离392

8.4.1 选择梯度条件393

8.4.1.1 梯度变化速率393

8.4.1.2 梯度范围394

8.4.1.3 梯度形状394

8.4.2 改变峰间距394

8.4.2.1 梯度变化速率395

8.4.2.2 溶剂类型398

8.4.2.3 其它条件398

8.4.3 调整色谱柱条件400

8.5 实验问题403

8.5.1 设备对分离的影响：系统的滞留体积404

8.5.1.1 设备差异404

8.5.1.2 不同PHLC系统分离效果的差异405

8.5.1.3 减少设备滞留体积的影响408

8.5.1.4 滞留体积的测定409

8.5.2 可重现的分离411

8.5.2.1 柱再生411

8.5.2.2 柱平衡411

8.5.2.3 不准确的梯度412

8.5.3 基线问题413

8.5.3.1 漂移413

8.5.3.2 人工峰414

8.6 梯度洗脱方法建立的总结414

8.6.1 系统方法415

8.6.2 计算机模拟416

第9章 常规样品反相分离的系统方法421

9.1 概论421

9.1.1 一些指导原则424

9.1.1.1 样品分类424

9.1.1.2 初始分离条件：色谱柱和流速425

9.1.1.3 初始分离条件：流动相426

9.1.1.4 其它初始分离条件427

9.1.1.5 确保准确的保留数据427

9.1.1.6 确保好的性能428

9.1.1.7 峰跟踪429

9.2 开始429

9.2.1 初始条件429

9.2.2 调整保留值范围430

9.2.2.1 等度分离431

9.2.2.2 梯度分离433

9.2.2.3 弱或强保留组分435

9.2.2.4 强疏水性阳离子435

9.2.2.5 复杂样品436

9.2.2.6 无样品峰437

9.2.3 评价峰型和柱效438

9.3 完成等度方法建立438

9.3.1 优化保留值和选择性440

9.3.1.1 样品A：简单分离440

9.3.1.2 样品B：典型的分离442

9.3.1.3 样品C：难分离的情况442

9.3.1.4 进一步改善分离448

9.3.1.5 以后样品方法的改变448

9.3.2 优化柱条件449

9.4 等度方法建立的另一途径451

9.5 完成梯度方法建立452

第10章 计算机辅助方法建立457

10.1 引言457

10.1.1 商品化与方法建立的软件概述458

10.2 计算机模拟软件459

10.2.1 改变%B和柱条件的等度分离459

10.2.1.1 利用其它变量改变选择性464

10.2.2 其它应用469

10.2.2.1 分段梯度472

10.2.3 其它应用472

10.3 溶剂类型优化软件473

10.4 网络—搜索软件（PESOS）477

10.5 基于分子结构的预测软件478

10.5.1 ELUEX480

10.5.2 CHROMDREAM482

10.5.3 特殊目的的程序482

10.6 方法的普适性482

10.7 峰跟踪484

10.7.1 标准品进样487

10.7.2 保留值与峰面积的比较489

10.7.4 光谱辨别490

10.7.3 保留值趋势490

10.8 缺陷492

11.1 引言496

第11章 生化样品：蛋白质，核酸，粮类及其有关化合物497

11.1.1 一级结构499

11.1.1.1 肽和蛋白质499

11.1.1.2 低聚核苷酸与核酸503

11.1.1.3 改性低聚核苷酸505

11.1.2 生化HPLC的特殊要求505

11.1.2.1 色谱柱505

11.1.2.2 样品分子的构象511

11.1.2.3 样品回收：质量和生物活性512

11.1.2.4 样品预处理512

11.1.2.5 样品检测514

11.2 肽与蛋白质样品的分离515

11.2.1 反相分离HPLC515

11.2.1.1 初始分离的较好条件516

11.2.1.2 用于改变选择性的参数520

11.2.1.3 常见问题与解决方案525

11.2.2 离子交换HPLC527

11.2.2.1 初始分离的优先条件530

11.2.2.2 改变选择性的参数534

11.2.2.3 常见问题与解决方案535

11.2.3 疏水作用色谱535

11.2.3.1 HIC分离的优选条件535

11.3 低聚核苷酸的分离537

11.3.2 离子交换HPLC539

11.3.1 离子对HPLC539

11.4.1 SEC保留的基础542

11.4 尺寸排阻色谱法542

11.4.2 应用545

11.4.3 SEC分离的优先条件548

11.4.4 常见问题与解决方案549

11.4.5 蛋白折叠550

第12章 手性分离557

12.1 引言557

12.1.1 手性衍生化558

12.1.2 手性流动相添加剂560

12.1.3 手性固定相（CSP）561

12.1.4 手性识别原理562

12.1.5 手性HPLC方法建立概论563

12.1.5.1 样品信息563

12.1.5.2 制备分离564

12.1.6 手性柱的选择565

12.2 固载化蛋白手性固定相566

12.2.1 引言566

12.2.2 本底567

12.2.3 手性作用机理567

12.2.4 蛋白质手性柱的性质568

12.2.5 由流动相调整保留值和选择性570

12.2.5.1 流动相有机调节剂571

12.2.5.2 pH，离子强度，离子对效应573

12.2.6 实验参数576

12.2.6.1 流动相的影响576

12.2.6.2 样品荷载及进样577

12.2.6.4 柱型578

12.2.6.5 柱维护及稳定性578

12.2.6.3 柱温578

12.2.7 应用及特殊技术580

12.2.8 系统方法的建立584

12.3 我聚糖（碳水化合物）柱586

12.3.1 引言586

12.3.2 商品化多聚糖固定相的性质586

12.3.2.1 一般性质587

12.3.2.2 效用588

12.3.3 手性分离机理590

12.3.4 实验参数592

12.3.4.1 流动相的选择592

12.3.4.2 柱温和压力的影响599

12.3.4.3 柱型和操作599

12.3.4.4 进样量599

12.3.5 应用600

12.3.6 方法建立策略600

12.4 给体-受体柱（Pirkle）602

12.4.1 引言602

12.4.2 商品化的给体-受体CSP的性质602

12.4.3 流动相条件606

12.4.3.1 溶剂607

12.4.4 Pirkle CSP的方法建立607

12.4.4.1 柱607

12.4.4.2 流动相607

12.4.4.3 衍生化610

12.4.4.4 温度和流速的影响610

12.5 空穴型柱614

12.5.1 引言614

12.5.2.2 反相模式618

12.5.2.1 分离模式618

12.5.2 使用未衍生化的CD柱分离方法的建立618

12.5.2.3 极性—有机模式和正相模式622

12.5.3 使用未衍生化的球糊精的方法建立622

第13章 制备HPLC的分离631

13.1 引言631

13.2 建立制备HPLC分离法633

13.2.1 一般考虑633

13.2.2 进样量的影响，切触谱带分离635

13.2.3 优化制备HPLD条件637

13.2.4 梯度分离640

13.2.5 痕量回收640

13.3 制备HPLC的实际方面642

13.3.1 样品溶解度642

13.4.1 一般关系式643

13.3.2 设备要求643

13.4 制备HPLC分离的定量预测643

13.4.2 色谱柱的饱和容量645

13.4.3 梯度洗脱分离645

13.4.4 严重超载条件下的分离646

13.5 制备HPLC方法建立的总结和示例650

13.5.1 批量制备HPLC他离1221654

第14章 定量（包括痕量分析）659

14.1 引言659

14.1.1 准确度，精密度和线性范围659

14.1.2 检测限和定量限660

14.2 信号的测量662

14.2.1 噪音662

14.2.3 峰面积664

14.2.2 峰高664

14.2.4 峰高与峰面积定量666

14.3 定量方法668

14.3.1 归一化法668

14.3.2 外标校正669

14.3.3 内标校正671

14.3.4 标准加入法673

14.4 定量误差的来源674

14.4.1 样品和样品处理675

14.4.2 色谱过程的影响677

14.4.3 数据系统的影响678

14.5 痕量分析679

14.5.1 样品制备680

14.5.2 柱分离度681

14.5.3 进样686

14.5.4 检测688

14.5.5 校正691

14.5.6 总体策略692

第15章 完善方法：论证和移植699

15.1 引言699

15.1.1 方法论证的一般方案700

15.2 准确度（Accuracy）701

15.2.1 与标准品比较701

15.2.2 被测物的回收测定702

15.2.3 标准品加入法703

15.3 精密度（Precision）703

15.4 线性（Linearity）705

15.5 范围（Range）707

15.6 检测限和定量限（Limit of Detection Limit of Quantitation）708

15.7 专属性（Specificity）710

15.7.1 掺入潜在干扰物711

15.7.2 样品降解研究711

15.7.3 峰收集与分析712

15.7.4 附加在线检测713

15.7.5 色谱交叉检测713

15.7.6 改变HPLC条件715

15.8 普适性（ruggedness）716

15.9 强健性（Robustness）716

15.10 稳定性（Stability）717

15.11 系统适用性（System Suitability）718

15.12 论证结果和最终方法的文件形成719

15.13 实验室的交叉研究（可移植性）721

15.13.1 测定等同性721

15.14 方法论证方案722