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第一章 基因工程药物概论1

第一节 基因工程药物与基因治疗1

一、基因工程药物1

二、基因治疗2

第二节 遗传工程3

一、动物遗传工程3

二、植物遗传工程3

第三节 基因药物研究的几项前沿技术4

一、反义技术4

二、三螺旋DNA技术6

三、DNA疫苗（核酸疫苗）7

第一节 基因重组技术8

第二章 基因药物研究的基本方法8

一、cDNA的克隆9

二、PCR扩增9

第二节 重组蛋白的表达12

第三节 蛋白质设计15

一、蛋白质变异16

二、蛋白质嵌合物16

第四节 基因工程技术在药物研究中的应用17

一、细胞膜受体作为药物研究的靶点17

二、抗原表型显示文库18

三、转基因动物18

四、基因治疗20

五、基因工程产品21

一、命名和分类23

第三章 基因工程中常用的酶23

第一节 限制性核酸内切酶23

二、Ⅱ类限制酶24

第二节 DNA连接酶28

第三节 DNA聚合酶29

一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ29

二、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow酶）29

三、T4 DNA聚合酶31

四、T7 DNA聚合酶32

五、测序酶32

六、逆转录酶32

七、Taq DNA聚合酶33

一、碱性磷酸酶34

八、末端转移酶34

第四节 核酸修饰酶34

二、T4多核苷酸激酶35

第五节 其他酶35

一、BAL 31核酸酶35

二、S1核酸酶36

三、绿豆核酸酶36

四、核糖核酸酶36

五、脱氧核糖核酸酶Ⅰ36

六、核酸外切酶36

二、典型的PCR操作38

一、原理38

第一节 概述38

第四章 聚合酶链反应38

第二节 反应条件39

一、缓冲液39

二、模板核酸39

三、引物40

四、底物(dNTP）40

五、酶40

六、反应条件的选择40

第三节 引物的设计41

第四节 耐热DNA聚合酶41

第五节 污染的控制42

一、预防42

三、处理43

二、污染源的追踪43

第六节 标本的制备44

第七节 PCR技术的新进展45

一、反向 PCR45

二、一步法扩增45

三、标记引物PCR45

四、定量PCR46

五、PCR固相分析法46

六、DNA单链构象多态性的PCR检测技术47

七、免疫PCR47

十一、多重PCR48

十、差异展示PCR48

九、不对称PCR48

八、锚定PCR48

十二、着色互补PCR49

十三、碱基替代PCR49

十四、单一特异引物PCR49

十五、臆断引物PCR49

十六、cDNA末端的快速扩增49

第八节 应用50

一、遗传性疾病的基因诊断50

二、检测病毒50

三、检测癌基因50

六、其他51

五、性别鉴定51

四、法医学中的应用51

第五章 基因文库的构建53

第一节 基因组文库53

一、载体54

二、外源DNA片段57

三、连接和包装58

四、保存和扩增58

五、基因组文库的调用59

第二节 cDNA文库的构建59

一、mRNA的分离59

二、cDNA第一链的合成62

四、载体63

三、cDNA第二链的合成63

五、cDNA的克隆64

六、λ噬菌体文库的扩增66

第六章 定点突变67

第一节 基本原理67

一、概述67

二、操作程序68

第二节 方法69

一、盒式诱变70

二、寡核苷酸引物诱变70

三、PCR诱变73

第三节 应用75

第七章 基因的克隆与测序78

第一节 目的基因的克隆78

一、材料的选择78

二、DNA片段的制备及克隆78

三、目的基因与载体的连接80

四、目的基因的转入83

五、重组体的筛选86

第二节 基因测序88

一、Sanger测序法88

二、化学降解法89

三、基因测序的策略90

四、DNA自动测序91

第三节 克隆基因的新方法92

一、外元捕捉法93

二、外元扩增法93

三、编码序列富集法94

四、岛屿获救PCR法94

五、核不均一RNA法94

六、消减杂交法和差别显示法95

七、动物园杂交法96

第四节 实验方法的改进96

第八章 表达载体的构建98

第一节 原核表达载体的构建98

一、调控元件98

二、融合蛋白型表达载体99

三、非融合型表达载体100

四、分泌型表达载体101

五、其他表达载体102

第二节 哺乳动物表达载体的构建103

一、功能元件103

二、筛选标记104

三、真核病毒序列105

四、报告基因107

五、其他表达系统108

第九章 真核基因在原核生物中的表达及调控110

第一节 概述110

一、大肠杆菌表达系统的特点110

二、表达真核基因的条件110

一、启动子111

第二节 表达载体的构建111

二、转录终止子113

三、核糖体结合位点114

第三节 真核基因在大肠杆菌中的表达形式115

一、胞内表达115

二、蛋白分泌型表达117

第四节 表达的调控118

一、DNA水平的调控118

二、转录水平的调控118

三、翻译水平的调控118

第五节 表达蛋白的提取和纯化120

一、提取120

五、影响表达的其他因素120

四、翻译后水平的调控120

二、纯化121

三、检测121

第十章 目的基因在真核生物中的表达与调控123

第一节 真核生物中的表达与调控123

一、转录前的基因调控124

二、转录水平的调控125

三、转录后水平的调控128

四、翻译水平的调控128

五、翻译后水平的调控129

六、内含子对基因表达的调控129

一、酵母表达系统130

第二节 真核生物表达系统130

二、昆虫细胞表达系统131

三、哺乳动物细胞表达系统131

第十一章 蛋白产物的分离纯化135

第一节 步骤135

一、细胞的破碎135

二、溶剂萃取137

三、离心138

四、析出140

五、柱层析142

六、膜分离146

第二节 分离路线148

第三节 应用148

七、蛋白的复性148

第十二章 干扰素151

第一节 概述151

一、序列结构151

二、分类151

三、生物学活性153

四、传统方法生产干扰素153

第二节 基因工程生产干扰素153

一、克隆及基因文库的构建153

二、基因文库的调用155

三、表达方法156

四、提取、纯化及鉴定161

五、活性检测161

一、临床治疗方面162

第三节 应用162

六、新型干扰素162

二、基础研究方面163

第十三章 白细胞介素165

第一节 概述165

第二节 IL-2167

一、基因结构167

二、蛋白质结构和理化性质167

三、IL-2基因的转录、激活及调控168

四、制备169

六、生物学活性172

七、应用172

五、检测172

第三节 IL-4173

一、基因结构173

二、蛋白质结构和理化性质174

三、制备174

四、检测175

五、生物学活性175

六、应用175

第四节 IL-6175

一、基因结构175

五、生物学活性176

四、检测176

三、制备176

二、蛋白质结构和理化性质176

六、应用177

第五节 IL-4受体177

一、基因结构177

二、蛋白质结构178

三、制备178

四、检测179

五、生物学活性179

六、应用179

一、基因和分子结构181

第一节 概述181

第十四章 促红细胞生成素181

二、来源及性质182

第二节 基因工程生产EPO183

一、基因克隆183

二、蛋白表达183

三、活性测定185

第三节 EPO受体185

一、基因结构185

二、空间结构及功能部位186

三、信息传递186

四、骨髓增生异常综合征性贫血187

三、结缔组织性贫血187

五、难治性贫血187

二、癌性贫血187

一、肾性贫血187

第四节 应用187

六、减少外科手术输血量188

第十五章 组织型纤溶酶原激活剂189

第一节 概述190

一、基因结构190

二、氨基酸特征192

三、理化性质及生物学活性192

第二节 基因工程生产t-PA194

一、基因克隆194

二、蛋白质工程194

三、生产工艺195

四、基因治疗196

五、检测197

第三节 应用197

第十六章 粒／巨噬细胞集落刺激因子199

第一节 概述199

一、基因结构199

二、蛋白质结构199

三、生物学活性200

第二节 基因工程生产GM-CSF201

一、基因文库的构建及克隆202

二、表达202

三、纯化204

四、生产技术的改进206

二、艾滋病207

第三节 应用207

一、肿瘤化疗所致的造血障碍207

三、骨髓异常增生综合征(MDS)和再生障碍性贫血208

四、骨髓移植208

五、增强免疫功能208

第十七章 粒系集落刺激因子210

第一节 概述210

一、基因结构210

二、蛋白质结构211

三、生物学活性212

第二节 基因工程生产G-CSF213

一、基因文库的构建及克隆213

二、表达214

三、纯化215

四、生产技术的改进216

第三节 应用218

一、中性粒细胞减少症218

二、白血病218

三、外周造血干细胞移植218

第十八章 基因工程抗体221

第一节 概述221

一、产生及分类221

二、结构221

三、基因定位221

四、功能222

第二节 基因工程生产抗体223

一、基因文库的构建223

二、嵌合抗体的制备225

三、双特异性抗体的制备227

四、生产技术的改进232

五、纯化233

六、检测234

第三节 应用234

一、诊断和治疗方面234

二、研究方面235

第十九章 基因工程疫苗237

第一节 概述237

一、保护性表位的筛选及鉴定237

第二节 乙肝疫苗238

一、酵母表达系统238

二、特定编码基因的克隆及表达238

二、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达系统240

三、重组病毒疫苗241

第三节 肿瘤疫苗242

一、肿瘤的识别与排斥242

二、分类242

三、导入肿瘤细胞的目的基因242

第四节 血吸虫疫苗243

一、GST的筛选过程244

二、相对分子量为62 000的肌球蛋白分子重链244

三、相对分子量为40 000的原肌球蛋白244

第五节 疟疾疫苗244

三、富含丝氨酸蛋白重复抗原(SERA）245

二、环子孢子蛋白245

一、裂殖子表面蛋白245

第六节 核酸疫苗246

一、研究进程246

二、疫苗的构建247

三、接种方式、途径及对免疫效果的影响247

四、免疫效果的检测248

五、免疫应答反应248

六、作用机制249

七、应用前景250

一、基本原理252

二、特点252

第一节 概述252

第二十章 基因诊断252

三、临床意义253

四、技术和方法253

第二节 核酸分子杂交254

一、基因探针254

二、杂交方法258

三、杂交信号检测260

第三节 PCR技术261

一、原理及发展261

二、原位PCR技术262

三、定量PCR技术264

四、PCR扩增产物的检测265

一、限制性酶切图谱直接分析法266

第四节 限制性片段长度多态性分析266

二、RFLP间接分析法267

第五节 扩增核酸和探针信号的几项新技术267

一、连接酶链反应268

二、Qβ复制酶系统268

三、信号放大269

第二十一章 基因治疗270

第一节 概述270

一、分类270

二、治疗方式270

三、治疗途径271

第二节 病毒载体基因转移技术271

一、逆转录病毒载体271

二、腺病毒载体273

三、腺病毒相关病毒载体274

四、痘苗病毒载体274

五、单纯疱疹病毒载体274

六、人工染色体275

第三节 非病毒介导的基因转移技术275

一、非病毒转移法275

二、病毒增强转移法276

第四节 基因治疗的靶向问题277

一、目的基因表达空间的定位277

二、目的基因表达时序的调控280

三、目的基因表达水平的调控281

二、肿瘤282

第五节 基因治疗的应用282

一、遗传病282

三、病毒性感染284

第六节 前景和存在的问题284

第二十二章 转基因动物和克隆动物286

第一节 转基因动物生物反应器286

一、由“巨鼠”到转基因动物系统287

二、研究概况287

三、研制转基因动物的方法287

四、转基因动物反应器的研制288

五、膀胱生物反应器的研制289

六、应用前景289

一、一个长期引起遗传学家兴趣的问题290

第二节 细胞周期与克隆动物290

二、细胞周期291

三、Wilmut的核转移方法291

四、动物克隆的一些基本方法292

五、发展前景296

第三节 基因剔除与特异基因的导入296

一、基因剔除296

二、特异基因的导入298

三、Cre-LoxP系统298

四、应用298

附录一 新生物制品审批办法302

附录二 载体系统306