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绪论1

一、体外培养的概念1

二、体外培养技术的发展历史2

(一)体外培养技术的创立2

(二)体外培养技术的发展3

(三)我国体外培养工作的发展情况7

三、体外培养技术的主要类别8

四、体外培养技术的应用8

(一)在组织学与胚胎学以及细胞生物学领域的应用8

(二)在肿瘤学方面的应用10

(三)在微生物学领域的应用11

(四)在免疫学方面的应用12

(五)在药理学领域的应用12

(六)动物细胞与微生物大规模培养技术在生产实践上的应用15

(七)在现代医学领域的应用16

(八)植物组织细胞培养技术的应用17

五、对体外培养技术的评价18

第一部 分体外培养的基本原理与技术21

第一章 从体内生存环境到体外生长条件21

第一节 体内细胞生存的营养条件21

一、水22

二、无机盐类22

三、葡萄糖24

四、维生素25

五、氨基酸26

第二节 体内细胞生存的其它条件27

一、温度27

二、氧和酸碱度28

三、体液渗透压29

四、细胞之间的相互联系29

第三节 体外生长大环境33

一、体外培养实验室33

二、体外培养的设备和器具35

(一)大型设备和仪器35

(二)培养器具42

第四节 培养用液50

一、水与平衡盐溶液51

(一)水与缓冲液51

(二)生理盐水与平衡盐溶液52

二、培养液54

(一)天然培养基54

(二)合成培养基57

(三)无血清培养基64

三、体外培养的其它常用液68

(一)其它常用液的类型68

(二)其它常用液的配制70

第五节 细胞在体外生长的其它条件71

一、无污染的气、液相环境71

二、温度72

三、生长基质73

第六节 清洗和消毒75

一、培养用具的清洗76

(一)玻璃器皿的清洗76

(二)胶塞和塑料用品的清洗77

(三)清洗后物品的包装77

二、培养用品的消毒和灭菌78

(一)物理方法78

(二)化学方法消毒82

第二章 体外培养的基本方法和过程87

第一节原代培养87

一、原代培养的过程88

(一)取材及培养材料的制备88

(二)分离(散)细胞的方法92

(三)接种与培养过程96

(四)更换培养液101

二、原代细胞培养方法的注意事项101

第二节 继代培养103

一、原代培养物需要传代的指标103

二、传代的过程104

三、传代培养的注意事项106

第三节 体外培养的基本方法和技术106

一、悬滴培养法107

(一)Maximow双盖片悬滴培养法110

(二)改良的植块悬滴培养法112

二、培养瓶培养法112

三、盖玻片培养法115

四、旋转管培养法115

五、灌注小室培养法117

六、培养板培养法120

七、二倍体细胞培养法121

八、克隆培养法122

九、中空纤维细胞培养技术123

十、微载体细胞培养法126

十一、微囊培养技术127

第四节 培养物的冻存与复苏128

一、培养物的冷冻保存与复苏原理129

(一)冷冻速率129

(二)冷冻保存温度130

(三)复温速率131

(四)冷冻保护剂131

二、冷冻保存方法132

(一)非玻璃化冻存方法132

(二)玻璃化冻存方法133

三、冻存细胞的复苏134

(一)非玻璃化冻存细胞的复苏方法134

(二)玻璃化冻存细胞的复苏方法135

第五节 培养物的污染136

一、微生物污染的判断136

(一)细菌的污染及其判断136

(二)真菌的污染及其判断137

(三)支原体的污染及其判断138

(四)病毒的污染及其判断140

二、污染的预防141

三、污染的排除141

第三章 体外培养物的生长生物学147

第一节 体外细胞培养物的生长类型147

一、黏附型细胞147

(一)上皮型细胞148

(二)成纤维细胞型细胞148

(三)游走型细胞149

(四)多形型细胞149

二、悬浮型细胞150

第二节 体外培养物的细胞生物学特点150

一、培养细胞分化状态的变化150

二、培养细胞的增殖能力151

三、体外培养细胞的生长过程152

(一)原代培养期152

(二)传代培养期155

(三)衰退期157

四、体外培养细胞的形态学158

五、植块培养物的生长生物学158

第三节 影响动物细胞体外生长的因素159

一、营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响159

(一)血清的成分与作用159

(二)无血清培养液的设计及应用161

(三)生长基质成分168

二、温度条件对细胞生长的影响169

三、气相环境对细胞生长的影响170

四、培养液的酸碱度对细胞生长的影响171

五、辐射线对细胞生长的影响172

六、超声波对细胞生长的影响173

七、影响细胞生长的其它因素173

第四章 细胞分离与纯化176

第一节 解离(散)组织制备细胞悬液过程中的细胞分离177

第二节 利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法179

一、一步密度梯度离心法181

(一)血细胞的分离181

(二)玫瑰花环细胞的分离183

二、等密度梯度离心法184

(一)连续BSA密度梯度离心法185

(二)非连续BSA密度梯度离心法186

(三)连续Percoll密度梯度离心法187

(四)非连续Percoll密度梯度离心法188

三、速度沉降法190

(一)低速离心速度沉降法190

(二)简单策略沉降法192

(三)简单重力沉降法分离白细胞与红细胞192

(四)简单重力沉降法分离粒细胞193

四、离心淘析分离技术194

第三节 根据细胞表面电荷的细胞分离方法195

一、自由流动电泳分离技术195

二、密度梯度电泳分离技术197

第四节 基于不同黏附特性的细胞分离方法197

一、差速黏附处理197

二、葡聚糖凝胶G-10过柱法198

三、羰基铁粉法200

四、尼龙毛分离法201

第五节 利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法202

一、免疫溶解法203

二、盘化法205

(一)直接法206

(二)间接法207

三、凝集素凝集法209

(一)花生凝集素凝集法分离皮、髓质胸腺细胞209

(二)大豆凝集素凝集法分离T、B淋巴细胞210

四、玫瑰花环分离法211

(一)E玫瑰花环分离法212

(二)EA玫瑰花环分离法213

(三)EAC玫瑰花环分离法214

五、流式细胞分选术216

(一)流式细胞仪的结构和工作原理217

(二)流式细胞术分选细胞219

六、免疫磁珠分离技术222

第六节 利用其它细胞学特性分离纯化细胞的方法226

一、反复植块法226

二、有丝分裂抑制剂处理226

第五章 细胞系(株)、细胞克隆与细胞周期同步化229

第一节 细胞系(株)的建立与鉴定229

一、基本概念229

二、建立细胞系(株)的档案230

三、细胞系的鉴定230

(一)细胞系鉴定的内容231

(二)细胞系形态学的鉴定方法231

(三)细胞系的染色体数目、核型及其带谱分析233

(四)细胞系的同工酶酶谱检测236

四、细胞系(株)的保藏240

五、国内部分已建立的细胞系或株名录241

六、国内部分已建立的单克隆抗体杂交瘤系或株名录243

七、国外部分已建立的细胞系或株名录245

第二节 细胞克隆250

一、克隆培养技术251

(一)稀释铺板法251

(二)饲养层克隆法252

(三)胶原膜板或血纤维蛋白膜层板克隆法253

(四)琼脂克隆法253

(五)在琼脂基底上用甲基纤维素克隆化254

二、影响克隆形成率的因素254

三、克隆的分离256

第三节 细胞周期与细胞同步化257

一、细胞周期257

二、细胞同步化261

(一)各期细胞的分离261

(二)细胞分裂相同步化法263

第六章 器官培养267

第一节 器官培养技术概论267

一、器官培养技术的基本要点267

二、器官培养技术的发展简史269

三、器官培养的基本原则271

(一)养分的供应与取材271

(二)抑制细胞迁移272

四、对器官培养技术的评价272

五、培养器官的生存环境及影响因素273

(一)培养器官的生存条件及其影响273

(二)培养器官的内在因素及其影响275

第二节 器官培养的基本方法276

一、表玻璃器官培养法276

二、琼脂凝胶培养法(Wolff器官培养法)278

三、悬浮培养法279

四、直接漂浮培养法279

五、擦镜纸培养法280

六、金属格栅器官培养法281

七、琼脂小岛器官培养法283

八、陈氏滤纸虹吸器官培养法284

九、灌注式器官培养法285

十、旋转管培养法287

十一、摇摆式器官培养法288

十二、器官灌注系统289

十三、鸡胚尿囊绒膜培养法289

十四、早期鸡胚胚盘培养法291

第三节 器官培养各论292

一、胚胎肢芽的器官培养292

(一)胚胎肢芽的血浆凝块器官培养方法292

(二)胚胎肢芽的琼脂凝胶培养法294

二、胚胎性腺的器官培养295

三、软骨与骨的器官培养296

(一)软骨的器官培养296

(二)骨的器官培养297

四、神经组织的器官培养298

五、牙胚的器官培养299

(一)Trowell培养法培养牙胚器官300

(二)悬浮培养法培养牙胚器官300

六、腭板的器官培养302

(一)腭板器官的静式培养法302

(二)腭板器官的转动培养法303

七、毛囊的器官培养304

八、血管的器官培养305

(一)血管的悬浮孵育法器官培养305

(二)血管的琼脂孔器官培养法306

九、肝脏的器官培养307

十、小梁网的器官培养308

十一、人胃肠黏膜的器官培养309

十二、胚胎器官的上皮与间充质植块的联合培养309

十三、肿瘤侵袭研究中的器官培养311

(一)肿瘤细胞与靶器官植块的制备312

(二)肿瘤细胞与器官植块几种联合培养模型313

第四节 全胚胎培养315

一、植入前胚胎培养315

二、植入后胚胎培养316

第五节 器官培养的应用317

一、器官培养中的形态发生研究317

二、器官培养与发育分化研究319

(一)外分泌腺的发育分化319

(二)内分泌腺的发育分化321

(三)性腺及前列腺的发育分化321

(四)神经组织的发育分化322

(五)各组织细胞间的相互作用对器官分化的影响322

三、体外培养整个胚胎的生长发育324

四、胚胎致畸作用研究324

五、器官的功能及其代谢研究326

六、器官移植中的应用326

(一)器官保存326

(二)降低免疫原性327

七、器官培养与肿瘤侵袭研究328

第七章 培养物的观察检测方法334

第一节 活细胞的观察检测方法334

一、相差显微镜观察培养物的形态结构334

(一)相差显微镜334

(二)用相差显微镜观察活细胞的方法336

(三)活细胞的动态观察与缩时电影338

二、细胞计数法339

三、细胞生长曲线340

四、体外活体染色观察与活体染料341

五、活细胞的染料排除检测法342

六、细胞增殖活性测定的3H-TdR掺入法342

七、细胞活力测定的MTT比色法343

第二节 普通染色观察343

一、HE染色法343

二、吉姆萨染色法344

三、载坡片处理方法345

第三节 细胞化学技术345

一、酸性磷酸酶345

二、葡萄糖-6-磷酸酶346

三、琥珀酸脱氢酶347

四、DNA与RNA的吖啶橙荧光染色法348

五、DNA的富尔根(Feulgen)染色法348

第四节 免疫细胞化学技术349

一、常用免疫细胞化学技术原理349

二、常用的显色标记物351

(一)辣根过氧化物酶351

(二)碱性磷酸酶351

(三)荧光素352

(四)胶体金与免疫金银技术353

三、免疫细胞化学方法及标记物的选择353

四、免疫细胞化学的一般问题354

五、免疫细胞化学染色的典型程序357

(一)免疫酶间接法357

(二)免疫荧光LSAB法357

(三)PAP法357

(四)SPA-胶体金银法358

第五节 原位杂交技术358

一、探针与标记物的选择358

二、原位杂交技术主要实验材料359

三、杂交362

四、显示标记物364

五、设立对照365

第六节 电子显微镜技术365

一、超薄切片技术366

(一)对培养物的预处理366

(二)标本制备367

二、电镜免疫细胞化学技术370

(一)显示细胞表面抗原370

(二)显示细胞内抗原370

三、其它电镜技术简介371

(一)扫描电镜技术371

(二)冷冻蚀刻复型技术372

第二部 分动物基本组织的体外培养375

第八章 上皮组织的体外培养375

第一节 上皮组织体外培养技术概论375

一、在体生长与体外培养的上皮组织的基本特点375

(一)上皮组织的形态结构375

(二)上皮细胞的极性376

(三)上皮细胞间的连接377

二、体外培养的上皮组织细胞的生长生物学377

(一)体外培养上皮细胞的形态结构377

(二)体外培养上皮组织的生长与增殖特征378

三、体外培养上皮组织细胞的观察与检测381

(一)一般形态学观察382

(二)组织化学与免疫组织化学观察与检测382

第二节 呼吸系统有关的上皮细胞培养383

一、呼吸道导气部上皮细胞的体外培养383

二、呼吸道导气部上皮分泌细胞的悬浮培养387

三、Ⅱ型肺泡细胞的培养388

四、鼻咽上皮细胞的体外培养390

第三节 消化系统有关的上皮细胞培养392

一、食管黏膜上皮细胞的培养392

二、胃黏膜上皮细胞的培养394

三、肠黏膜上皮细胞的培养395

四、胆囊和肝外胆管上皮细胞的培养397

第四节 腺上皮细胞的体外培养399

一、唾液腺上皮细胞的培养399

二、乳腺上皮细胞的培养401

(一)乳腺上皮细胞原代培养的建立和维持401

(二)乳腺上皮细胞的悬浮培养403

(三)乳腺上皮细胞在EHS基质上的培养405

(四)乳腺上皮细胞的其它培养方法406

(五)乳腺上皮细胞培养中的有关问题408

第五节 表皮细胞的体外培养409

一、表皮角质形成细胞的饲养层细胞培养法409

二、角质形成细胞的复合培养法412

(一)在人去表皮真皮上培养角质形成细胞412

(二)在真皮替代物上培养角质形成细胞414

三、表皮黑(色)素细胞的培养415

四、表皮郎格汉斯细胞的培养419

第六节 血管内皮细胞的体外培养421

一、猪主动脉内皮细胞的培养421

二、免主动脉内皮细胞的体外培养424

三、人脐静脉内皮细胞的培养425

四、大鼠主动脉内皮细胞的培养426

五、滤膜培养法培养血管内皮细胞427

六、免脑微血管内皮细胞培养428

七、大鼠肺微血管内皮细胞的培养429

第七节 胸腺上皮细胞的体外培养430

第九章 结缔组织的体外培养436

第一节 结缔组织细胞的生长生物学特点与基本分离技术436

一、结缔组织细胞的生长生物学特点436

二、体外培养结缔组织细胞的基本分离技术440

第二节 结缔组织细胞培养各论442

一、成纤维细胞的体外培养442

(一)真皮成纤维细胞的体外培养442

(二)人包皮成纤维细胞的无血清培养445

(三)中国仓鼠胚胎成纤维细胞的体外培养447

(四)鸡胚成纤维细胞的体外培养448

(五)人胚肺成纤维细胞的体外培养449

(六)小鼠肾间质成纤维细胞的体外培养450

(七)眼组织成纤维细胞的体外培养452

二、巨噬细胞的体外培养452

(一)获取肺泡巨噬细胞的方法453

(二)获取腹腔巨噬细胞的方法453

(三)巨噬细胞的纯化455

(四)巨噬细胞的接种和培养455

三、脂肪细胞的体外培养456

(一)大鼠前脂肪细胞的原代培养457

(二)小鼠前脂肪细胞的原代培养458

四、肥大细胞的体外培养460

(一)肺肥大细胞的体外培养460

(二)肠肥大细胞的体外培养462

(三)皮肤肥大细胞的分离和短期培养464

五、间充质干细胞的体外培养465

(一)鸡胚肢芽间充质干细胞的体外培养465

(二)大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养467

(三)人骨髓间充质干细胞的体外培养469

(四)兔骨髓间充质前体细胞的体外成软骨培养470

第十章 几种重要脏器细胞与特殊动物细胞的体外培养473

第一节 眼组织细胞的体外培养473

一、角膜上皮细胞和内皮细胞的体外培养473

(一)角膜上皮细胞的培养473

(二)角膜内皮细胞的培养475

二、小梁细胞的体外培养476

三、视网膜色素上皮细胞的体外培养478

四、晶状体上皮细胞的体外培养481

五、视网膜米勒细胞的体外培养482

第二节 骨与软骨组织的体外培养484

一、成骨细胞的培养485

(一)骨内成骨细胞的培养485

(二)骨膜内成骨细胞培养487

二、破骨细胞的培养488

(一)成熟破骨细胞分离细胞培养法489

(二)骨髓长时间培养诱导分仑形成破骨细胞法490

三、滑膜细胞的培养491

(一)滑膜植块培养法492

(二)分离的滑膜细胞培养法493

四、软骨细胞的培养494

(一)关节软骨细胞的短期培养494

(二)人关节软骨细胞的长期培养法496

第三节 泌尿生殖系统有关的几种细胞培养498

一、生精细胞的体外培养498

二、睾丸支持细胞的培养499

三、睾丸间质细胞的培养501

四、肾小管上皮细胞的培养502

五、肾小球系膜细胞的培养504

第四节 几种内分泌细胞的体外培养505

一、胰岛细胞的体外培养505

二、人垂体腺瘤细胞培养507

三、甲状腺细胞的体外培养510

第五节 羊水细胞的体外培养511

一、羊水细胞的体外培养基本方法512

二、羊水细胞的富集培养法513

第六节 胚胎干细胞的体外培养514

一、体外培养胚胎干细胞的技术原理515

二、体外培养胚胎干细胞的基本过程515

(一)饲养层细胞的培养515

(二)饲养单层的制备518

(三)用于培养胚胎干细胞的条件培养基的制备519

(四)胚胎干细胞的分离与培养520

(五)胚胎干细胞的冻存与复苏525

三、胚胎干细胞的鉴定525

(一)碱性磷酸酶检测525

(二)核型的鉴定526

(三)体外分化能力观察527

(四)体内分化能力的观察527

(五)嵌合能力的测定528

第十一章 造血干细胞的检测与造血祖细胞的体外培养534

第一节 概论534

一、造血干细胞的生物学特征535

(一)造血干细胞的基本特性535

(二)对造血干细胞的识别536

(三)造血干细胞的胞龄结构536

(四)造血干细胞的动力学538

二、造血祖细胞539

第二节 造血干细胞的测定技术540

一、CFU-S的检测技术541

二、以标记染色体测定脾结节的形成543

三、脾结节移植法测定脾结节CFU-S545

第三节 体外培养造血祖细胞的特殊实验材料546

一、培养用液546

二、特异性刺激因子的制备549

(一)横纹肌条件培养液的制备549

(二)白细胞条件培养液551

(三)脾细胞条件培养液551

(四)再障病人血清的制备552

(五)胎肝细胞裂解液的制备553

第四节 造血祖细胞的体外富集与培养554

一、造血祖细胞的富集554

(一)单个核细胞的分离554

(二)CD34+细胞及其分离方法557

(三)CD34+细胞的MACS免疫磁性分离方法558

二、造血祖细胞的体外培养559

三、各类造血祖细胞的培养技术561

(一)CFU-GM的培养561

(二)红系造血祖细胞的培养564

(三)巨核造血祖细胞的培养567

(四)混合细胞集落的培养570

(五)白血病细胞的培养571

(六)无血细胞体内扩散匣培养技术571

四、造血细胞体内扩散匣培养技术572

第五节 造血祖细胞培养技术的实际应用574

一、正常人骨髓内各种造血祖细胞的含量测定574

二、某些血液疾病的细胞病理学575

三、药物对造血细胞的作用研究576

四、再生障碍性贫血的发病机制和预后以及造血干细胞移植治疗577

五、体外测定造血祖细胞辐射敏感性与全身放射敏感性反应的关系580

第十二章 血淋巴细胞的体外培养585

第一节 各类淋巴细胞的主要特征585

一、T淋巴细胞585

(一)T细胞的表面标志585

(二)T细胞亚群及其功能587

二、B淋巴细胞587

(一)B细胞的表面标志587

(二)B细胞的亚群589

三、大颗粒淋巴细胞589

(一)NK细胞589

(二)K细胞590

第二节 血淋巴细胞的分离590

一、单个核细胞的分离591

二、纯淋巴细胞的制备593

(一)玻璃黏附法593

(二)羰基铁粉法593

三、T细胞和B细胞的分离594

(一)T细胞花环沉降法594

(二)尼龙毛柱分离法596

四、大颗粒淋巴细胞的分离597

五、荧光激活细胞分离仪分离淋巴细胞及其亚群597

六、免疫磁珠法分离各种淋巴细胞及其亚群599

第三节 血淋巴细胞的体外培养方法和应用599

一、淋巴细胞转化试验599

二、B细胞产生免疫球蛋白的检查602

三、T细胞介导的细胞毒试验603

四、NK细胞毒性试验605

五、K细胞毒性试验607

六、LAK细胞的制备609

七、淋巴细胞的体外长期培养610

(一)用IL-2建立T淋巴细胞克隆610

(二)用EB病毒转化B淋巴细胞611

(三)用B细胞生长因子建立B淋巴细胞株612

第十三章 肌肉组织的体外培养615

第一节 肌肉组织体外培养技术概论615

一、肌肉组织体外培养技术的发展简史616

二、肌肉组织细胞培养的意义与评价617

第二节 心肌细胞的体外培养618

一、心肌细胞培养的基本原理618

二、心肌细胞培养用液619

(一)常用平衡盐溶液619

(二)心肌细胞培养液619

(三)其它培养用液621

三、心肌细胞的培养方法621

(一)心肌细胞的原代培养622

(二)成年动物的搏动心肌细胞的制备625

(三)心肌细胞培养方法的某些发展628

四、心肌细胞培养的基本结果与观测方法630

(一)一般观察630

(二)培养心肌细胞的形态学观察630

(三)心肌细胞搏动的观察632

五、培养心肌细胞的某些电生理特性633

六、培养心肌细胞代谢的某些特点634

第三节 平滑肌细胞的体外培养636

一、平滑肌细胞体外培养方法636

二、培养平滑肌细胞的结果与鉴定640

三、影响血管平滑肌细胞增殖的因素643

第四节 骨骼肌细胞的体外培养643

一、骨骼肌细胞培养所需主要材料644

二、骨骼肌细胞培养方法646

(一)乌类骨骼肌细胞的培养646

(二)啮齿类动物骨骼肌细胞原代培养方法647

(三)从啮齿类动物肌肉中获取高纯度肌源性细胞的新方法651

三、肌源性细胞系的建立652

第十四章 神经组织的体外培养656

第一节 神经元的体外培养656

一、神经组织的植块培养法656

(一)概述656

(二)灰质组织或神经节的体外培养657

(三)白质植块的培养657

二、神经元的分离细胞培养方法657

(一)材料的来源658

(二)神经元体外培养液658

(三)神经元体外培养的生长基质661

(四)神经元的分离细胞培养过程661

(五)神经元细胞的体外培养661

三 神经干细胞的体外培养663

第二节 神经胶质细胞的体外培养663

一、星形胶质细胞的体外培养663

(一)取材的动物年龄与部位663

(二)星形胶质细胞的体外培养方法665

(三)星形胶质细胞的无血清限定性培养液666

(四)星形胶质细胞的形态学特征与化学标志物666

二、少突胶质细胞的体外培养667

(一)体外纯化过程667

(二)体外培养少突胶质细胞的化学限定性培养基668

(三)少突胶质细胞的化学标志物668

(四)少突胶质细胞的形态学特征669

三、施旺细胞的体外培养669

(一)施旺细胞的体外培养方法669

(二)施旺细胞的无血清限定性培养基670

(三)施旺细胞体外生长的形态学特征与化学标志物670

四、小胶质细胞的体外培养671

(一)小胶质细胞的体外培养方法671

(二)小胶质细胞的形态学特征与鉴定671

五、其它神经胶质细胞的体外培养672

六、体外培养神经组织分离细胞的形态学特征比较672

第三节 各类神经组织细胞的培养方法673

一、鸡胚背根节的体外培养673

二、大鼠颈上神经节的体外培养676

三、大鼠小脑皮质神经元的体外培养676

四、大鼠星形胶质细胞的体外培养678

(一)方法一：植块培养法678

(二)方法一：分离细胞培养法679

五、大鼠少突胶质细胞的体外培养682

(一)方法一：植块培养法683

(二)方法二：密度梯度离心法683

(三)方法三：恒温摇床处理法684

六、大鼠施旺细胞的体外培养686

(一)方法一：常规分离细胞培养法686

(二)方法二：免疫选择法687

(三)方法三：反复植块法689

七、鼠脑小胶质细胞的体外培养689

八、脊髓神经元的体外培养690

(一)方法一：差速黏附处理富集脊髓神经元培养法690

(二)方法二：台面选淘富集脊髓前角运动神经元培养法692

九、鼠脑神经干细胞的体外培养695

(一)胚胎神经干细胞的体外培养695

(二)成年脑组织内神经干细胞的体外培养698

十、大鼠胚胎几种常用脑区组织体外培养的取材699

第三部分 特殊类动物细胞的体外培养705

第十五章 肿瘤细胞的体外培养705

第一节 肿瘤细胞在体内和体外的生长特性概论706

一、肿瘤细胞在体内生长的特征706

二、肿瘤细胞在体外的生长生物学特性707

三、肿瘤细胞在体内和体外的生长特征差别708

四、体外培养肿瘤细胞常用的培养基709

第二节 体外培养肿瘤组织细胞的方法和技术710

一、肿瘤组织细胞的原代培养710

二、肿瘤细胞的传代715

三、肿瘤细胞的克隆培养法716

第三节 肿瘤细胞体外生长的细胞生物学特征718

一、肿瘤细胞体外生长的形态学与细胞学特征718

二、肿瘤细胞的核型和异常生长特性720

(一)染色体数目及核型720

(二)永生性721

(三)异质性723

(四)动物接种成瘤性724

(五)非锚着生长依赖性724

第四节 已建立的肿瘤细胞系介绍725

一、国内已建立的人类肿瘤细胞系介绍725

二、国际上已建立的人类肿瘤细胞系726

第五节 部分肿瘤细胞的体外培养与建系过程727

一、人鼻咽癌细胞系(CNE-2)的建立727

二、人骨肉瘤细胞系(HOS-8603)的建立728

三、大鼠肝卵圆细胞的本外培养730

四、人神经母细胞瘤细胞系的建立731

五、人肺腺癌细胞系的建立732

六、有肺巨细胞癌细胞系的建立732

七、人肾颗粒细胞癌细胞系的建立733

八、人卵巢癌细胞系的建立734

九、人肝癌细胞系的建立734

十、人喉腺泡型横纹肌肉瘤细胞系的建立735

十一、人恶性胸膜间皮瘤细胞系的建立736

十二、人乳腺癌细胞系(HATTORI)的建立736

第六节 肿瘤细胞培养的应用737

一、肿瘤细胞对组织浸润的体外研究737

二、人恶性肿瘤细胞的动物移植瘤研究740

三、培养肿瘤细胞的体外分化实验742

四、培养肿瘤细胞的凋亡诱导研究745

第十六章 病原微生物的培养750

第一节 病原微生物培养技术概论750

一、病原微生物培养的基本原理751

二、病原微生物培养的基本方法和技术752

三、病原微生物培养的应用754

第二节 细菌的培养755

一、细菌培养的基本条件755

(一)细菌培养基755

(二)细菌生长的其它条件756

二、细菌生长繁殖的特点757

三、细菌培养的基本技术758

(一)无菌操作技术758

(二)细菌接种技术758

四、细菌培养的方法760

(一)一般培养法760

(二)二氧化碳培养法760

(三)厌氧培养法761

五、各别类细菌的培养762

(一)致病性葡萄球菌的培养762

(二)幽门螺旋杆菌的培养764

(三)结核杆菌的培养766

(四)淋球菌(淋病奈瑟氏菌)的培养767

第三节 其它类菌的培养769

一、放线菌的培养769

(一)放线菌培养的一般条件769

(二)放线菌培养基769

二、真菌的培养770

(一)真菌培养的一般条件770

(二)常见致病真菌的培养基771

三、支原体培养772

(一)支原体培养的一般条件772

(二)常见病原支原体的培养基773

四、立克次体的培养774

(一)立克次体培养的一般条件774

(二)常见病原立克次体的培养775

五、衣原体培养775

(一)衣原体培养的一般条件775

(二)常见的病原性衣原体的培养776

六、螺旋体的培养776

(一)螺旋体培养的一般条件776

(二)钩端螺旋体培养基777

(三)常见病原螺旋体的培养778

第四节 病毒的培养778

一、宿主细胞培养法779

二、鸡胚培养法780

三、各别类宿主细胞培养法782

(一)EB病毒的培养782

(二)脊髓灰质炎病毒的培养784

(三)乙型肝炎病毒DNA转染细胞系的建立和应用787

第十七章 医学寄生虫的体外培养790

第一节 寄生虫的体外培养技术概论790

一、寄生虫的营养与代谢特点790

二、寄生虫的体外培养技术类别791

(一)寄生虫虫体培养791

(二)寄生虫细胞培养792

(三)寄生虫的体外培养常用培养基792

三、寄生虫体外培养技术的应用794

(一)在生物学研究中的应用794

(二)在病理与免疫学研究中的应用795

(三)在药物学研究中的应用796

第二节 疟原虫体外培养797

一、疟原虫红外期体外培养797

(一)约氏疟原虫红外期的体外培养797

(二)人疟原虫红细胞外期体外培养799

二、疟原虫红内期体外培养801

(一)体外长期连续培养801

(二)同步培养法803

(三)疟原虫冷冻保存技术804

三、恶性疟原虫配子体的体外培养804

第三节 机会性致病原虫的体外培养807

一、弓形虫的体外培养807

(一)速殖子的培养方法之一：单层贴壁细胞接种培养法807

(二)速殖子的培养方法之二：悬浮细胞的接种培养法809

(三)速殖子的培养方法之三：在鸡胚中种植的培养法809

(四)包囊的培养810

(五)弓形虫的冷冻保存技术811

二、卡氏肺孢子虫体外培养812

(一)用非洲绿猴肾细胞系培养卡氏肺孢子虫813

(二)用胎儿肺成纤维细胞系培养卡氏肺孢子虫814

三、隐孢子虫体外培养814

(一)在组织细胞内培养815

(二)在鸡胚中培养816

第四节 日本血吸虫体外培养816

一、培养基及培养条件817

(一)培养基的种类817

(二)培养条件817

二、各期培养方法818

(一)尾蚴人工转变童虫体外培养818

(二)肺期童虫体外培养819

(三)成虫体外培养820

(四)虫卵的体外培养821

(五)毛蚴至母胞蚴的体外培养821

(六)子胞蚴和尾蚴的体外培养822

(七)血吸虫成虫和童虫细胞的培养823

第五节 棘球绦虫体外培养823

一、细粒棘球绦虫的体外培养824

(一)囊型发育824

(二)链体发育825

(三)成虫体外培养825

(四)细胞培养826

二、多房棘球绦虫体外培养827

(一)多房棘球绦虫虫体培养827

(二)多房棘球绦虫细胞培养828

第十八章 无脊椎动物组织的体外培养832

第一节 无脊椎动物细胞培养的基本方法和技术833

一、体外培养无脊椎动物细胞的基本条件833

(一)无脊椎动物细胞培养基833

(二)无脊椎动物细胞常用培养基的配方835

(三)昆虫组织培养基的配制847

(四)体外培养无脊椎动物细胞的其它条件849

二、无脊椎动物细胞的原代培养850

三、无脊椎动物细胞的传代培养852

四、无脊椎动物细胞的悬浮培养854

五、培养细胞的低温保存和冷冻保存855

第二节 无脊椎动物的器官培养855

一、软体动物器官的体外培养856

二、蠊翅目昆虫的体外器官培养856

第三节 无脊椎动物细胞系(株)的建立859

一、昆虫细胞系的建立859

(一)鳞翅目859

(二)双翅目862

(三)蠊翅目864

二、昆虫缺陷型细胞株的建立867

三、软体动物细胞系的建立868

(一)蜗牛细胞系的建立869

(二)牡蛎细胞的离体培养874

四、蜱螨(扁虱)细胞系的建立876

五、建立细胞系的注意事项881

第四节 无脊椎动物细胞的大规模培养882

一、大规模悬浮细胞培养的添加剂882

二、低剪切力连续生物反应器884

三、有血清培养基扩大规模培养昆虫细胞技术884

(一)扩大规模培养的主要材料885

(二)扩大规模培养方法886

四、无血清培养基扩大规模培养昆虫细胞技术888

第四部分 体外培养技术的应用897

第十九章 体外培养的应用技术897

第一节 细胞分化与体外诱导分化897

一、正常细胞分化897

二、EC、ES和EG细胞系898

三、ES和EG细胞培养和建系的基本技术899

(一)饲养层细胞899

(二)胚胎细胞来源900

(三)ES和EG细胞的培养过程900

(四)ES和EG细胞系特性和鉴定902

四、ES细胞体外诱导分化904

(一)ES细胞体外诱导分化的意义904

(二)ES细胞体外诱导分化的基本原理905

(三)ES细胞体外诱导分化的基本方法905

(四)ES细胞体外分化的细胞类型907

五、诱导分化细胞的永生化911

第二节 细胞融合技术911

一、病毒融合法912

二、聚乙二醇诱导细胞融合法914

三、电诱导细胞融合法915

第三节 体外受精技术917

一、体外受精的基本实验条件918

(一)体外受精所需的主要仪器设备和消耗用品918

(二)体外受精与胚胎培养环境的设备和管理919

(三)胚胎培养液919

二、胚胎的体外培养922

(一)卵母细胞的收集922

(二)精子的体外获能923

(三)体外受精925

(四)卵裂观察及胚胎评分927

三、胚胎移植928

第四节 基因转染技术与体外细胞转化929

一、基因转染技术930

(一)待转染细胞的准备930

(二)质粒DNA的纯化931

(三)基因转染的方法932

(四)转染细胞的筛选936

二、体外细胞转化937

(一)细胞转化的概念与细胞转化的过程937

(三)诱变因素诱发培养细胞转化的程序938

三、转基因动物939

第五节 杂交瘤技术与单克隆抗体制备技术940

一、杂交瘤技术940

(一)B淋巴细胞杂交瘤技术的实验流程941

(二)应用于杂交瘤技术中的培养用液942

(三)杂交瘤细胞的染色体分析943

(四)杂交瘤细胞的染色体分析948

二、单克隆抗体949

(一)单克隆抗体的概念949

(二)单克隆抗体的鉴定950

(三)单克隆抗体的生产和提纯952

(四)单克隆抗体技术的发展953

第二十章 动物细胞大规模培养958

第一节 动物细胞培养有关的特性959

一、动物与微生物细胞的差别959

二、动物细胞生长特性960

第二节 发酵960

一、培养方法961

(一)贴壁培养961

(二)悬浮培养962

(三)固定化培养962

二、动物细胞培养的发酵工艺964

(一)分批式培养965

(二)流加式培养966

(三)半连续式培养966

(四)连续式培养967

(五)灌注培养967

三、发酵工艺条件及其控制968

(一)培养基968

(二)培养温度的调节控制969

(三)培养液酸碱度的调节控制969

(四)溶解氧的调节控制969

四、动物细胞大规模培养用生物反应器974

(一)搅拌罐生物反应器974

(二)气升式生物反应器979

(三)鼓泡式生物反应器981

(四)中空纤维生物反应器982

第三节 动物细胞微载体培养技术984

一、动物细胞在微载体表面的贴壁生长机制985

二、微载体的主要特性986

三、微载体的种类及其性质987

(一)交联葡聚糖为基质的微载体987

(二)塑料为基质的微载体988

(三)明胶/变性胶原微载体988

(四)玻璃为基质的微载体988

(五)纤维素为基质微载体989

(六)液膜微载体989

(七)大孔微载体989

四、微载体的选择993

第四节 动物细胞大规模培养技术的应用993

一、在疫苗生产上的应用994

二、在干扰素生产上的应用994

三、在单克隆抗体生产上的应用994

四、在其它基因重组产品生产上的应用995

第五部分 植物组织细胞的培养999

第二十一章 植物组织细胞培养的基本原理与技术999

第一节 植物组织细胞培养技术的概念和类别999

一、植物组织细胞培养的基本概念999

二、植物组织细胞培养技术的类别1001

第二节 植物组织培养技术的发展简史1002

一、植物组织细胞培养技术的创立阶段1002

二、植物组织细胞培养技术的发展阶段1004

三、植物组织细胞培养技术的应用研究阶段1006

第三节 植物组织细胞培养技术概述1007

一、植物组织细胞培养的基本条件1007

(一)植物组织细胞培养的营养条件1007

(二)植物组织细胞培养的环境条件1009

二、植物组织细胞培养的基本方法和技术1011

(一)植物组织细胞培养的基本方法1011

(二)植物组织细胞培养的基本技术1011

三、植物组织细胞培养的基本程序1013

四、植物组织细胞培养物离体生长的基本方式1015

(一)直接芽分化的方式1016

(二)通过愈伤组织形成的方式1016

(三)胚状体形成的方式1020

五、植物组织细胞培养物的鉴定1021

(一)植物组织培养物的组织学观察1021

(二)植物组织培养物的染色体观察1023

六、植物组织培养技术与动物组织培养技术的异同1025

第四节 植物组织细胞离体培养时的生物学特征1026

一、植物组织细胞离体培养条件下的全能性1026

(一)植物组织细胞的全能性具有普遍性1026

(二)植物组织细胞全能性实现的途径1027

二、植物组织细胞离体培养条件下的突变性1029

(一)植物组织细胞的变异性具有广泛性1029

(二)离体培养的植物组织细胞变异机制1031

三、植物组织细胞离体培养条件下的类减数分裂现象1034

(一)植物组织细胞类减数分裂现象的存在1034

(二)体细胞类减数分裂发生的机制1035

第二十二章 植物组织细胞培养各论1037

第一节 植物的胚胎培养1037

一、植物胚胎培养的概念1037

二、植物的幼胚培养1038

(一)幼胚培养的基本过程1038

(二)植物幼胚培养的实例1041

三、植物的成熟胚培养1042

四、植物的胚珠培养1042

(一)胚珠培养的基本过程1043

(二)胚珠培养的实例1044

五、子房的培养1046

(一)子房培养的基本过程1046

(二)植物子房培养实例1048

六、植物的胚乳培养1049

(一)胚乳培养的基本过程1050

(二)植物的胚乳培养实例1052

第二节 植物的器官培养1053

一、植物器官培养的概念1053

二、离体根培养1053

(二)根培养的基本过程1054

(二)植物离体根的培养实例1055

三、离体茎培养1056

(一)离体茎培养的基本过程1056

(二)植物茎尖培养的实例1060

四、离体叶培养1062

(一)叶培养的基本过程1062

(二)叶器官培养的实例1063

五、植物花器官的培养1064

(一)花培养的基本过程1064

(二)花器官培养的实例1065

六、植物种子和果实培养1066

(一)种子和果实培养的基本过程1067

(二)植物种子和果实培养的实例1068

第三节 植物的组织培养1069

一、植物的组织培养概念1069

二、植物愈伤组织的培养1069

三、植物胚性愈伤组织的培养1071

(一)植物胚性愈伤组织培养的基本过程1071

(二)植物愈伤组织培养及植株再生实例1074

第四节 植物的细胞培养1076

一、植物细胞培养的概念1076

二、植物细胞悬浮培养1076

(一)植物细胞悬浮培养的基本过程1076

(二)悬浮细胞的培养实例1086

三、植物的单细胞培养1087

(一)植物单细胞培养的基本过程1087

(二)植物单细胞培养实例1091

第五节 植物的花药与花粉培养1092

一、植物花药与花粉培养的概念1092

二、植物的花药培养1092

(一)花药培养的基本过程1092

(二)植物花药培养实例1098

三、植物的花粉培养1099

(一)花粉培养的基本过程1099

(二)植物花粉培养实例1102

第六节 植物的原生质体培养1103

一、原生质体培养的概念1103

二、原生质体的培养1103

(一)原生质体培养的基本过程1103

(二)原生质体培养实例1115

第二十三章 植物组织细胞培养的应用1118

第一节 植物组织细胞培养的应用技术1118

一、植物基因转移技术1118

(一)植物基因的获取1118

(二)植物基因的载体1120

(三)植物基因的转移方法1120

(四)转基因植物的检测1123

(五)植物基因转移实例1126

二、植物体细胞融合技术1129

(一)原生质体融合的基本方法1129

(二)原生质融合体的生长发育1134

(三)原生质体融合实例1137

三、植物体外受精技术1137

四、快速繁殖植物技术1139

第二节 植物组织细胞培养在农业上的应用1141

一、利用植物组织培养技术改良植物品质1141

(一)利用植物组织培养技术进行倍性育种1142

(二)利用植物组织培养技术进行远缘杂交育种1146

(三)利用植物细胞培养技术进行突变育种1149

二、利用植物组织培养技术培育脱毒植物1157

(一)利用茎尖培养技术进行植物脱毒1157

(二)利用植物组织培养技术进行植株脱毒1159

(三)利用植物组织培养技术快速繁殖植物1160

三、利用植物组织培养技术保存植物种质1162

(一)植物组织细胞超低温保存的优点1162

(二)植物组织细胞超低温保存技术1162

(三)植物超低温种质保存实例1165

四、利用植物组织培养技术合成人工种子1167

(一)人工种子的特点1167

(二)人工种子的应用前景1168

(三)人工种子制作的基本技术1169

(四)人工种子制作实例1172

第三节 植物组织细胞培养技术与植物产品生产1173

一、利用植物组织细胞培养技术工厂化生产试管苗1173

(一)用植物组织细胞培养技术建立植物的无性系1173

(二)试管苗工厂化生产实例1176

二、利用植物细胞大量培养技术生产植物产品1179

(一)培养的植物组织细胞积累次生代谢物的特点1180

(二)培养的植物组织细胞积累的次生代谢物之类别1180

(三)利用植物组织细胞培养技术生产次生代谢物的方法1180

(四)利用植物组织细胞培养生产次生代谢物的实例1182

第四节 利用植物细胞培养技术生产植物药1185

一、利用植物细胞培养技术生产植物药的优势和不足1185

二、利用植物组织培养技术生产的植物药的类别1186

三、植物药物生产的主要技术1187

(一)发状根培养技术1187

(二)两相培养技术1188

(三)反义技术1189

四、利用植物组织细胞技术生产植物药的实例1190

五、植物药工业化生产实例1194

附录1196

附录Ⅰ无血清培养基及添加剂供应商一览表1196

附录Ⅱ水合物的等量值表1197

附录Ⅲt界值表1198

附录Ⅳ离心机转速(r/min)与相对离心力(RCF)的列线图1199