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第一章 免疫应答导论1

单元1.1酶联免疫吸附试验1

基本方案 间接ELISA法检测特异性抗体2

备选方案1直接竞争ELISA法检测可溶性抗原4

备选方案2抗体夹心ELISA法检测可溶性抗原5

备选方案3双抗体夹心ELISA法检测特异性抗体7

备选方案4夹心ELISA法检测同种型9

备选方案5直接细胞ELISA法检测细胞表面抗原9

备选方案6间接细胞ELISA法检测抗细胞表面抗原的特异性抗体11

辅助方案 十字交叉连续稀释分析法（criss-cross serial-dilution analysis）测定试剂最适浓度12

单元1.2多克隆抗血清的制备14

基本方案 使用弗氏佐剂制备多克隆抗体的免疫接种法15

备选方案 使用其他佐剂制备多克隆抗体的免疫接种法16

辅助方案 从血液中制备血清17

单元1.3单克隆抗体的制备18

基本方案1单克隆抗体制备中的免疫接种19

基本方案2细胞融合与杂交瘤分选20

辅助方案1杂交瘤培养上清的筛选分析23

辅助方案2杂交瘤的建系23

辅助方案3有限稀释克隆法24

辅助方案4克隆和扩增用培养基的制备25

单元1.4单克隆抗体培养上清与腹水的制备26

基本方案1单克隆细胞培养上清的制备26

备选方案1单克隆细胞培养上清的大规模制备27

备选方案2杂交瘤或细胞系细胞的大规模制备27

基本方案2含有单克隆抗体的腹水制备28

单元1.5免疫球蛋白G（IgG）的纯化29

基本方案1硫酸铵沉淀和凝胶过滤层析29

基本方案2蛋白A交联琼脂糖凝胶亲和层析31

备选方案1蛋白G交联琼脂糖凝胶亲和层析32

备选方案2抗大鼠κ链单克隆抗体交联琼脂糖凝胶亲和层析33

单元1.6免疫球蛋白G（IgG）片段的水解34

基本方案1木瓜蛋白酶水解IgG成Fab片段摸索性试验34

基本方案2木瓜蛋白酶水解IgG获取Fab片段的大量制备35

基本方案3胃蛋白酶水解IgG成F（ab′）2片段的摸索性试验36

基本方案4胃蛋白酶水解IgG获取F（ab′）2片段的大量制备37

备选方案 用预先活化的木瓜蛋白酶水解IgG制备F（ab）238

单元1.7免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白D（IgD）的纯化39

基本方案1用透析和凝胶过滤层析法纯化IgM39

备选方案1硫酸铵沉淀法纯化IgM39

备选方案2甘露聚糖结合蛋白亲和纯化IgM40

备选方案3 IgM纯化试剂盒41

基本方案2凝集素亲和层析法纯化小鼠IgD41

单元1.8抗体可变区（V区）的克隆、表达和修饰42

基本方案1通过使用冗余引物克隆和表达免疫球蛋白可变区43

辅助方案TA载体的制备48

基本方案2用ELISA法鉴定转染细胞分泌的抗体分子49

基本方案3转染细胞分泌抗体分子的鉴定50

单元1.9核酸免疫52

基本方案1小鼠注射接种DNA53

基本方案2小鼠基因枪接种DNA55

辅助方案1包裹DNA的金粉颗粒的制备56

辅助方案2制备包裹有DNA的金粉颗粒的样品管57

辅助方案3基因枪接种中氦气压力和颗粒大小的最优化59

第二章 小鼠淋巴细胞功能的体内体外分析61

单元2.1小鼠单个核细胞的分离63

基本方案 从脾脏、胸腺和淋巴结制备细胞悬液63

辅助方案1去除脾脏细胞悬液中的红细胞63

辅助方案2一步梯度法去除死细胞64

单元2.2磁珠法分离T细胞和B细胞64

基本方案1用AUTOMACS系统进行总T细胞、CD4＋细胞或CD8＋T细胞的自动分离64

基本方案2使用AUTOMACS系统进行B细胞的自动分选65

基本方案3使用AUTOMACS系统进行辅助细胞的自动分选66

备选方案1用磁性分选柱手工操作分离淋巴细胞66

基本方案4用AUTOMACS系统自动分选CD4＋CD25＋抑制性细胞67

备选方案2用磁性分选柱手工操作分离CD4＋CD25＋抑制性细胞68

单元2.3树突细胞的分离69

基本方案1塑料黏附和EA玫瑰花结富集DC70

辅助方案 胶原酶消化制备脾脏细胞悬液72

基本方案2用小鼠骨髓前体细胞培养树突细胞（DC）73

单元2.4从小鼠脾脏分离小鼠天然杀伤细胞75

基本方案75

单元2.5 B细胞功能的检测77

基本方案1抗原特异性的抗体产生77

基本方案2 Jerne-Nordin PFC测定法81

基本方案3 Cunningham-Szenberg PFC测定法83

备选方案1改良Jerne-Nordin PFC测定法用于型特异性反应85

备选方案2改良Jerne-Nordin PFC测定法用于测定多克隆抗体反应85

辅助方案1制备琼脂糖包被的玻片85

辅助方案2制备Cunningham-Szenberg小室86

辅助方案3三硝基苯半抗原（TNP）偶联SRBC86

辅助方案4蛋白质A偶联SRBC87

辅助方案5制备TNP-卵白蛋白88

辅助方案6用Percoll梯度离心纯化静息B细胞88

单元2.6 B淋巴细胞活化的早期事件90

基本方案1 BCR诱导的B细胞内钙变化90

基本方案2蛋白质酪氨酸磷酸化的分析91

基本方案3细胞大小与B细胞活化分子表达的分析92

单元2.7 B细胞功能的增殖检测方法93

基本方案抗IgM与LPS刺激的B细胞增殖93

备选方案1用8-巯基喹啉（8-MG）刺激B细胞多克隆活化94

备选方案2用蛋白激酶C激活剂及钙离子载体刺激B细胞多克隆活化95

备选方案3硫酸葡聚糖与poly （I：C）刺激B细胞多克隆活化95

备选方案4细胞数量增加的定量95

单元2.8 BrdU检测T细胞和B细胞增殖96

基本方案96

单元2.9采用细胞内荧光染料CFSE检测淋巴细胞的迁移和增殖97

基本方案 淋巴细胞的CFSE标记97

辅助方案 流式细胞仪分析CFSE标记的细胞99

单元2.10细胞毒性丁淋巴细胞的诱导及检测101

基本方案1从CTL前体中诱导细胞毒性101

基本方案2铬释放法分析CTL活性103

辅助方案1次要组织相容性抗原的小鼠体内应答105

辅助方案2病毒抗原体内免疫小鼠105

辅助方案3 TNP修饰靶／刺激细胞106

辅助方案4病毒感染靶／刺激细胞106

备选方案1多克隆CTL活性的诱导106

备选方案2 CTL再定向杀伤活性的检测107

单元2.11 T淋巴细胞增殖实验107

基本方案1未致敏T淋巴细胞的活化107

备选方案1用抗体激活未致敏的T细胞109

备选方案2混合淋巴细胞增殖实验110

辅助方案1从抗原呈递细胞或刺激细胞悬液中剔除T淋巴细胞110

辅助方案2辅助／刺激细胞的灭活111

基本方案2致敏T细胞的活化112

基本方案3 CD4＋CD25＋T细胞的活化和抑制功能的检测113

备选方案3 CD4＋CD25＋T细胞抑制功能的两步法检测：短期活化和扩增CD4＋CD25＋T细胞并分析其抑制功能114

单元2.12 T细胞克隆的建立115

基本方案1产生和维持同种反应性Th和CTL克隆115

基本方案2用可溶性蛋白抗原诱导Th克隆116

辅助方案1制备刀豆蛋白A活化的上清（Con A上清）118

辅助方案2制备混合淋巴细胞培养上清（MLC上清）118

辅助方案3制备PMA激活的EL-4淋巴瘤细胞上清（EL-4上清）119

辅助方案4用显微操作的方法克隆119

单元2.13制备小鼠T细胞杂交瘤120

基本方案 细胞融合和T细胞杂交瘤的选择120

辅助方案1筛选表达CD3-TCR原始杂交瘤123

辅助方案2筛选抗原特异性的杂交瘤124

单元2.14检测凋亡和其他形式的细胞死亡125

基本方案1用活细胞或荧光染料定量细胞活性125

基本方案2 DNA裂解片段的定量126

备选方案 计数放射性标记的DNA定量细胞中DNA片段127

辅助方案1用125I UdR和5 1 Cr放射性标记细胞核127

辅助方案2用3H TdR放射性标记细胞核128

第三章 细胞活化的生物化学129

单元3.1淋巴细胞活化过程中肌醇磷脂周转的分析130

基本方案1通过道威克斯（DDWEX）离子交换层析分析［3H］肌醇磷酸130

备选方案 通过HPLC方法分析［3H］肌醇磷酸131

基本方案2通过薄层层析方法分析肌醇磷脂132

单元3.2抗磷酸化酪氨酸的印迹检测133

基本方案 抗磷酸化酪氨酸印迹检测的准备及分析133

备选方案 使用125I标记蛋白A进行检测135

单元3.3免疫复合物方法检测酪氨酸蛋白激酶135

基本方案 酪氨酸蛋白激酶的免疫沉淀和自身磷酸化检测136

备选方案1蛋白激酶对外源底物的磷酸化检测138

备选方案2蛋白激酶对外源底物的磷酸化检测138

单元3.4识别特异性酪氨酸磷酸化多肽抗体的制备139

基本方案1多克隆抗磷酸肽抗体的制备139

基本方案2制备抗磷酸肽的单克隆抗体141

辅助方案1肽的合成144

辅助方案2肽段偶联到Affi-Gel 10亲和性基质144

辅助方案3磷酸酪氨酸偶联到Affi-Gel 10亲和基质145

单元3.5 T细胞中丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）活性分析146

基本方案1免疫复合物蛋白激酶测定146

基本方案2固相蛋白激酶法检测JNK活性147

基本方案3 SDS-PAGE后原位检测JNK蛋白激酶活性［“胶内”（IN-GEL）激酶测定］149

基本方案4利用磷酸化位点特异性抗体检测MAPK的活化150

辅助方案 制备GST-MAPK底物融合蛋白151

单元3.6脂筏的分离和应用153

基本方案 通过蔗糖梯度浮选法制备去污剂抗性的膜并通过免疫印迹对蛋白质进行分析153

备选方案 用离心法制备去污剂抗性的膜156

辅助方案1脉冲追踪方法分析去污剂抗性的膜蛋白157

辅助方案2通过放射性标记检测去污剂抗性的膜蛋白的全部组分157

辅助方案3定量高效薄层色谱法（HP-TLC）进行DRM脂质分析158

辅助方案4 DEAE葡聚糖凝胶的制备161

辅助方案5 C18反相色谱柱的制备162

辅助方案6用甲基-β-环式糊精去除胆固醇来破坏脂筏163

辅助方案7甲基-β-环式糊精（MBCD）处理去除胆固醇的动力学测定163

辅助方案8使用 MBCD-胆固醇复合物进行细胞胆固醇去除164

第四章 免疫荧光和细胞分离166

单元4.1细胞制备和试剂166

基本方案1单细胞表面抗原的免疫荧光标记166

基本方案2固定和渗透单细胞的细胞内抗原的免疫荧光标记167

辅助方案1用异硫氰酸荧光黄（FITC）偶联抗体169

辅助方案2长臂生物素偶联抗体170

备选方案1未固定细胞胞内抗原的免疫荧光检测170

备选方案2用7-氨基放线菌素D（7-AAD）标记死细胞171

单元4.2流式细胞仪分析技术-BD公司出品的流式细胞仪172

基本方案FITC偶联抗体的单色分析173

辅助方案1用校准微球和FACSComp软件进行仪器检测175

辅助方案2单色分析区分活细胞和死细胞176

备选方案1 FITC和PE偶联抗体的双色分析177

辅助方案3双色分析区分活细胞和死细胞177

备选方案2三色分析178

备选方案3四色分析178

第五章 细胞因子及其受体181

单元5.1 IL-2和IL-4的检测183

基本方案 采用CTLL-2细胞检测小鼠IL-2和IL-4183

备选方案1采用CTLL-2细胞检测人IL-2186

备选方案2采用CT.4S细胞检测小鼠IL-4186

备选方案3采用CT.h4S细胞检测人IL-4187

辅助方案1白细胞介素或T细胞生长因子（TCGF）单位的计算187

辅助方案2小鼠CTLL-2细胞的维持188

辅助方案3小鼠CT.4S细胞的维持189

辅助方案4小鼠CT.h4S细胞的维持189

单元5.2 IL-10的检测190

基本方案190

单元5.3 IL-12的检测191

基本方案 人和小鼠IL-12 p75异二聚体的ELISA检测方法192

备选方案 人和小鼠IL-12 p40亚基的ELISA检测193

单元5.4 IL-13的检测193

基本方案193

单元5.5 IL-15的检测194

基本方案194

单元5.6 IL-18的检测196

基本方案196

单元5.7 γ干扰素的检测197

基本方案197

单元5.8流式细胞仪检测细胞内因子199

基本方案 细胞内因子的荧光标记199

辅助方案1 PMA和ionomycin激活T细胞200

辅助方案2抗原活化T细胞201

辅助方案3固定和冻存PBMC202

辅助方案4 PBMC的细胞表面标记202

辅助方案5用荧光标记的抗细胞因子抗体标记活化细胞内的细胞因子203

单元5.9流式细胞仪检测细胞因子受体204

基本方案 用抗受体单克隆抗体检测人和小鼠的细胞因子受体204

备选方案1用标记的细胞因子检测细胞因子受体206

备选方案2多参数分析检测淋巴细胞亚群细胞因子受体的表达207

辅助方案1单克隆抗体和细胞因子的滴定208

辅助方案2评价检测试剂209

单元5.10用流式细胞仪检测细胞因子的分泌和分离分泌细胞因子的细胞210

基本方案 细胞因子分泌实验210

备选方案1 PBMC分泌细胞因子的快速检测212

备选方案2全血细胞分泌细胞因子的快速检测213

单元5.11 ELISPOT方法检测分泌细胞因子的细胞214

基本方案214

单元5.12α-、β-和γ-干扰素诱导的抗病毒活性的检测218

基本方案 小鼠干扰素诱导的抗病毒活性的检测218

辅助方案1病毒培养体系的建立220

辅助方案2抗体中和实验220

备选方案 人干扰素诱导的抗病毒活性的检测221

单元5.13趋化因子超家族的生物学反应221

基本方案1微型趋化实验检测趋化因子对粒细胞的趋化221

备选方案1微型趋化实验检测趋化因子对单核细胞的趋化226

备选方案2微型趋化实验检测趋化因子对淋巴细胞的趋化227

辅助方案 细胞外基质蛋白包被聚碳酸酯膜228

基本方案2趋化因子诱导的淋巴细胞内游离钙离子的检测228

第六章 天然免疫231

单元6.1小鼠巨噬细胞的分离232

基本方案1小鼠腹腔巨噬细胞的分离232

基本方案2小鼠骨髓巨噬细胞的分离和培养233

单元6.2小鼠巨噬细胞的表型检测234

基本方案 直标法检测小鼠巨噬细胞的表型235

备选方案 间标法检测小鼠巨噬细胞的表型236

单元6.3人单核／巨噬细胞的表型检测237

基本方案237

单元6.4小鼠巨噬细胞的活化239

基本方案 小鼠巨噬细胞的活化239

辅助方案 炎性小鼠巨噬细胞的活化240

单元6.5巨噬细胞一氧化氮的检测241

基本方案241

单元6.6巨噬细胞吞噬功能和杀伤功能的检测242

基本方案1巨噬细胞吞噬功能的检测243

辅助方案 利用FI1C区分胞外黏附和胞内吞噬的细菌244

基本方案2巨噬细胞杀伤功能的检测244

辅助方案 单核细胞增多性利斯特氏菌的制备245

单元6.7巨噬细胞抗肿瘤活性的检测246

基本方案［111 In］释放法检测巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用246

辅助方案［111 In］标记肿瘤靶细胞249

单元6.8 Fcγ受体介导的黏附作用和吞噬作用的检测251

基本方案Fcγ受体介导的吞噬作用251

辅助方案FcγR介导的黏附作用253

单元6.9干扰素介导的抗肿瘤作用254

基本方案254

单元6.10人NK T细胞的分离和扩增255

基本方案1 NK T细胞的鉴定255

基本方案2免疫磁珠法分离NK T细胞及后续扩增256

备选方案1 NK T细胞的流式分选及扩增258

备选方案2 NK T细胞的克隆258

辅助方案NK T细胞的二次刺激和克隆259

第七章 抗原加工处理和呈递261

单元7.1抗原呈递细胞的选择和制备261

基本方案 通过利斯特氏菌刺激制备腹腔巨噬细胞262

备选方案1连续注射利斯特氏菌和？蛋白胨后制备腹腔巨噬细胞263

辅助方案1小鼠腹腔注射用利斯特氏菌的制备263

备选方案2 Con A刺激的腹腔巨噬细胞的制备264

备选方案3骨髓来源的巨噬细胞的制备264

辅助方案2制备L929条件培养基265

备选方案4制备LPS刺激的B细胞266

单元7.2外源性抗原向T细胞的呈递266

基本方案 一种抗原加工处理和呈递的检测体系267

备选方案1用固定后的贴壁型抗原呈递细胞检测加工处理过的抗原肽268

备选方案2用固定后的非贴壁型抗原呈递细胞检测加工处理过的抗原肽269

备选方案3蛋白抗原致敏的细胞固定后检测抗原加工和处理269

第八章 人类免疫学研究271

单元8.1外周血和脐带血中分离单个核细胞271

基本方案Ficoll-Hypaque梯度离心法分离单个核细胞272

辅助方案 贴壁法去除单个核细胞中的单核细胞和巨噬细胞272

单元8.2 T细胞亚群的分离纯化273

基本方案 间接淘洗法分离T细胞亚群273

备选方案 抗体依赖补体介导的细胞毒作用分离T细胞亚群274

辅助方案1应用神经氨酸酶处理的绵羊红细胞玫瑰花环形成法分离T细胞275

辅助方案2应用AET处理的绵羊红细胞玫瑰花环形成法分离T细胞276

单元8.3免疫磁珠法纯化T细胞276

基本方案276

单元8.4免疫磁珠法分离B细胞亚群278

基本方案278

单元8.5单核细胞／巨噬细胞的分离280

基本方案1贴壁法分离单核细胞280

基本方案2根据大小沉降作用分离单核细胞280

基本方案3对流离心洗淘法分离单核细胞281

单元8.6人自然杀伤细胞的分离283

基本方案从PBMC分离人NK细胞284

辅助方案 阴性选择分离NK细胞的单克隆抗体的滴定285

单元8.7流式细胞仪检测全血的人淋巴细胞286

基本方案286

单元8.8淋巴细胞增殖实验288

基本方案 丝裂原诱导的外周血单个核细胞增殖实验288

备选方案1单向混合淋巴细胞反应290

备选方案2抗原诱导的T细胞增殖实验292

辅助方案3H TdR掺入和细胞收集292

单元8.9 B细胞分泌抗体的检测293

基本方案293

单元8.10 ELISA检测抗体的含量294

基本方案294

单元8.11 ELISPOT检测抗体的含量295

基本方案ELISPOT检测分泌抗体的细胞296

备选方案用ELISPOT检测仪检测分泌抗体的细胞298

单元8.12抗体的体内诱导和检测299

基本方案1蛋白质或多糖抗原体内法诱导抗体的产生299

基本方案2 ELISA法检测体内抗体的产生300

辅助方案 肺炎球菌多糖与蛋白质的偶联3

单元8.13 T细胞杀伤功能的检测302

基本方案1抗CD3诱导的T细胞杀伤实验302

基本方案2抗原诱导的特异性T细胞杀伤功能的检测303

单元8.14 NK／LAK细胞杀伤活性的检测303

基本方案51Cr释放法检测NK／LAK细胞杀伤活性304

辅助方案 肿瘤靶细胞的制备和标记306

单元8.15人T细胞的克隆和扩增307

基本方案1抗原特异性T细胞的诱导307

基本方案2 Th1或Th2细胞的诱导308

辅助方案1 T细胞的克隆310

辅助方案2克隆后T细胞的扩增311

辅助方案3 T细胞克隆的冻存312

单元8.16制备EBV转化的B细胞313

基本方案313

单元8.17分离人肠黏膜单个核细胞314

基本方案 分离人肠黏膜单个核细胞314

辅助方案 用尼龙毛过滤器去除死细胞316

单元8.18人树突细胞分离和培养317

基本方案1从外周单个核细胞中分离人树突细胞317

备选方案 免疫磁珠法分离树突细胞319

基本方案2用单核细胞诱导人树突细胞319

单元8.19分离和鉴定人自然杀伤细胞亚群321

基本方案从PBMC中分离人NK细胞321

辅助方案人NK细胞亚群的表型和功能分析322

第九章 HIV的检测与分析326

单元9.1外周血中HIV的分离和定量检测327

基本方案1外周血中HIV的培养以及通过TCID定量来测定其滴度327

基本方案2感染同种异型T淋巴母细胞：原代分离PBMC中的HIV329

辅助方案 评估HIV对CD4＋靶细胞的致细胞病变效应：HIV介导的细胞死亡329

单元9.2感染CD4＋原代细胞系及HIV的诱导330

基本方案1用HIV体外急性感染CD4＋原代细胞及细胞系330

基本方案2建立HIV慢性感染细胞系332

基本方案3慢性感染细胞系中HIV的诱导333

单元9.3在单核细胞和巨噬细胞中培养HIV334

基本方案 单核细胞来源的巨噬细胞培养和HIV感染334

备选方案用HIV悬液感染单核细胞来源的巨噬细胞336

辅助方案1扩增实验室保存的亲巨噬细胞的HIV-1病毒株336

辅助方案2扩增原代分离的亲巨噬细胞的HIV-1病毒株337

单元9.4 HIV蛋白的检测338

基本方案1免疫印迹法检测HIV蛋白339

基本方案2免疫荧光法检测HIV蛋白340

备选方案 流式细胞仪分析细胞内HIV蛋白342

基本方案3 HIV反转录酶活性检测343

单元9.5用PCR检测HIV的DNA及RNA345

基本方案1用PCR扩增及检测HIV的DNA345

基本方案2用RT-PCR检测HIV的RNA349

单元9.6体外评价各种制剂的抗HIV活性352

基本方案1保护靶T细胞免受HIV致细胞病变效应352

基本方案2表达CD4的HeLa细胞合胞体斑形成抑制试验353

基本方案3 ELISA检测抗病毒剂对PBMC中HIV p24抗原产生的抑制作用355

辅助方案50％抑制浓度（IC50）的计算357

单元9.7基于痘苗病毒报道基因细胞融合检测法定量功能性测定HIV包膜糖蛋白与受体的相互作用358

基本方案 用质粒表达包膜蛋白及受体进行融合检测359

备选方案1用重组病毒对各种成分的融合试验361

备选方案2活化的可溶性CD4融合检测362

辅助方案1比色法测定融合-依赖的报道基因活性362

辅助方案2原位染色测定报道基因活性363

第十章 自身免疫性及炎症性疾病动物模型365

单元10.1小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）366

基本方案 应用PLP和MBP蛋白或多肽主动诱导EAE366

备选方案MBP或PLP特异性淋巴细胞被动转移性诱导EAE369

辅助方案1 PLP蛋白的纯化369

辅助方案2 MBP蛋白的纯化370

单元10.2大鼠佐剂性关节炎371

基本方案 佐剂性关节炎的诱导371

辅助方案 分枝杆菌悬液的制备373

单元10.3胶原诱导性关节炎373

基本方案 诱导小鼠胶原性关节炎374

辅助方案1 II型胶原（CII）的纯化375

辅助方案2胶原（II）α1链的纯化376

辅助方案3胶原（II）α1链内溴化氰裂解片段的纯化377

辅助方案4小鼠关节炎的评定380

辅助方案5检测CIA小鼠T细胞对CII的增殖应答381

单元10.4小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎382

基本方案1实验性自身免疫性甲状腺炎的诱导和评定382

辅助方案 小鼠甲状腺球蛋白的制备384

基本方案2诱导EAT耐受385

单元10.5小鼠实验性自身免疫性重症肌无力386

基本方案EAMG的诱导和评定386

辅助方案1 AChR的抽提与亲和纯化388

辅助方案2神经毒素3-琼脂糖的制备390

辅助方案3应用肌电图评定EAMG391

辅助方案4通过检测抗AChR抗体来评定EAMG391

辅助方案5小鼠肌肉AChR的制备393

单元10.6 NOD小鼠：一种胰岛素依赖性糖尿病模型394

基本方案1无特殊病原菌（SPF）级NOD小鼠的饲养394

基本方案2胰岛素依赖性糖尿病（IDDM）的诊断396

备选方案 半定量胰岛炎以作为进展为IDDM的亚临床表现396

辅助方案 胰腺中胰岛细胞的分离398

单元10.7通过耗竭调节性T细胞诱导自身免疫性疾病400

基本方案 通过胸腺切除术诱导年轻的成年大鼠糖尿病400

备选方案 应用胸腺切除术诱导3周龄大鼠糖尿病402

单元10.8通过耗竭调节性T细胞诱导免疫缺陷小鼠炎症性肠道疾病402

基本方案 转输CD45RBhigh CD4＋ T细胞诱导SCID小鼠IBD402

辅助方案 监测IBD进展404

单元10.9气道高反应性动物模型406

基本方案 应用OVA全身致敏及气道激发诱导气道超敏反应406

辅助方案1使用全身体积气压描记器非侵入性检测气道反应性407

备选方案OVA致敏气道诱导气道超敏反应408

辅助方案2体外检测气道对电场刺激的反应性409

辅助方案3 T细胞功能和气道炎症的评定410

单元10.10诱导小鼠TNBS结肠炎411

基本方案 小鼠TNBS结肠炎的诱导和评定411

辅助方案1分离小鼠肠系膜淋巴结细胞412

辅助方案2分离结肠炎小鼠的黏膜固有层细胞413

单元10.11系统性红斑狼疮动物模型414

基本方案1 ELISA检测小鼠血清中抗染色质抗体415

基本方案2单链和双链DNA抗体的检测416

基本方案3 ELISA检测类风湿因子417

基本方案4 ELISA检测同种异型特异性抗体时标准曲线的制作417

备选方案ELISPOT检测抗染色质抗体形成细胞420

辅助方案1低渗裂解鸡红细胞核制备鸡染色质421

辅助方案2 dsDNA的制备421

辅助方案3基于PCR技术的faslpr突变体和fasLgld突变体的基因分型422

第十一章 传染性疾病动物模型425

单元11.1利什曼原虫感染的小鼠模型425

基本方案 皮肤利什曼原虫病小鼠模型425

辅助方案1使用花生凝集素制备后发育期前鞭毛体427

辅助方案2从足垫组织中纯化无鞭毛体428

辅助方案3前鞭毛体和无鞭毛体的冷藏和复苏429

辅助方案4血琼脂培养板的制备430

单元11.2弓形虫感染动物模型430

基本方案1诱导小鼠急性弓形虫T.gondii感染431

基本方案2小鼠慢性弓形虫脑炎模型431

基本方案3感染T.gondii的重症联合免疫缺陷小鼠432

基本方案4温度敏感的TS-4 T.gondii菌株的感染模型432

辅助方案1对T.gondii感染进展和免疫应答的评估433

辅助方案2 ME49 T.gondii包囊种子库的维持和保存435

辅助方案3用人类包皮成纤维细胞保存T.gondii速殖子436

辅助方案4小鼠体内保存T.gondii速殖子436

辅助方案5 T.gondii裂解物抗原的准备437

单元11.3巨细胞病毒感染小鼠模型的建立438

基本方案 巨细胞病毒感染小鼠模型438

辅助方案1巨细胞病毒的准备439

辅助方案2唾液腺病毒的制备440

辅助方案3用空斑形成细胞试验测定巨细胞病毒滴度441

辅助方案4原代小鼠胚胎成纤维细胞的制备441

单元11.4单核细胞增生性利斯特氏菌感染动物模型442

基本方案 用单核细胞增生性利斯特氏菌株感染小鼠443

辅助方案1小鼠感染利斯特氏菌后的特异性和固有免疫反应评估444

辅助方案2利斯特氏菌特异性T细胞的制备445

单元11.5淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒感染动物模型447

基本方案1全身性感染LCMV小鼠模型447

基本方案2 LCMV病毒持续感染小鼠模型449

基本方案3 T细胞对LCMV免疫反应的测定450

基本方案4 LCMV疫苗效果的体内检测451

辅助方案1 LCMV病毒储存液的制备452

辅助方案2噬菌斑试验测定LCMV病毒滴度453

辅助方案3 ELISA检测LCMV抗体454

单元11.6流感病毒454

基本方案1流感病毒鼻腔内感染麻醉的小鼠455

备选方案 流感病毒鼻腔内感染未麻醉小鼠455

辅助方案1流感病毒在鸡胚中扩增455

辅助方案2鸡胚尿囊液内流感病毒滴度的测定457

辅助方案3 MDCK细胞的长期培养458

辅助方案4培养组织流感病毒感染剂量（TCID50）的测定458

辅助方案5小鼠50％致死剂量（MLD50）和小鼠50％感染剂量（MID50）459

辅助方案6检测流感病毒滴度的小鼠肺脏制备461

辅助方案7流感病毒储存液中血凝单位的测定462

辅助方案8小鼠血清的血凝抑制试验（HAI）463

辅助方案9流感病毒储存液（原液）的系列稀释464

基本方案2从脾脏前体细胞获得流感病毒特异性的细胞毒T淋巴细胞（CTL）464

基本方案3收集含抗流感病毒CTL的肺脏细胞465

辅助方案10流感病毒中和试验466

第十二章 蛋白质分离和分析468

单元12.1免疫亲和层析468

基本方案 可溶性或膜结合抗原的分离468

备选方案1抗原低pH洗脱471

备选方案2用辛烷基β-D-葡糖苷洗脱抗原471

单元12.2免疫沉淀472

基本方案1用非变性去垢剂裂解细胞制成的悬液进行免疫沉淀472

备选方案1用含非变性去垢剂溶液裂解的贴壁细胞进行免疫沉淀476

备选方案2用含变性去垢剂裂解液裂解的细胞进行免疫沉淀476

备选方案3用无去垢剂裂解液裂解的细胞进行免疫沉淀476

备选方案4用抗体-Sepharose进行免疫沉淀477

辅助方案 抗体Sepharose的制备479

备选方案5用与ANTI-Ig结合的放射性标记的抗原进行免疫沉淀480

基本方案2再次捕获免疫沉淀480

单元12.3单向蛋白质凝胶电泳483

基本方案483

单元12.4凝胶蛋白质染色486

基本方案1考马斯亮蓝染色486

基本方案2银染486

基本方案3 SYPRO Orange或SYPRO Red荧光染色487

基本方案4 SYPRO Ruby荧光染色488

备选方案1聚丙烯酰胺凝胶上磷蛋白的特异性荧光染色489

辅助方案 磷酸酪氨酸残基的特异性检测490

备选方案2同一块凝胶上的糖基化蛋白和非糖基化蛋白的差异性荧光染色491

单元12.5免疫印迹和免疫检测492

基本方案1液体容器中的蛋白质印迹492

备选方案1半干胶系统蛋白质印迹494

辅助方案1转移蛋白的可逆染色495

基本方案2采用二抗检测的免疫探针法495

备选方案2亲和素-生物素化二抗的免疫探针法496

基本方案3生色底物显色497

备选方案3生色底物显色498

辅助方案2膜蛋白解离与再生499

第十三章 肽500

单元13.1合成肽用以制备识别完整蛋白质的抗体500

基本方案1通过计算机辅助方法选择合适的抗原肽序列500

备选方案1通过人工筛查挑选合适的肽序列501

基本方案2设计一条肽链与载体蛋白相偶联502

备选方案2设计合成一条多价抗原肽503

基本方案3使用双功能团试剂将合成肽偶联至载体蛋白504

备选方案3使用双功能团试剂将合成肽偶联至载体蛋白505

辅助方案 计算肽连接到载体蛋白上的摩尔率505

单元13.2抗多肽血清的制备507

基本方案1在兔体内制备抗多肽血清的免疫接种流程507

基本方案2用间接ELISA法检测抗多肽抗体滴度507

基本方案3使用酸性、碱性或离液洗脱液的亲和层析柱508

辅助方案1预先溶胀的NHS或CNBr活化树脂的肽免疫亲和层析柱的制备509

辅助方案2巯基化树脂填充的肽亲和层析柱的制备511

单元13.3采用合成肽组合库鉴定B细胞和T细胞的表位512

基本方案1采用PS-SCL筛选抗体抑制剂512

基本方案2筛查PS-SCL鉴定CD4＋或CD8＋T细胞的配体514

辅助方案 优化用于筛查的抗原和抗体浓度515

第十四章 分子生物学518

单元14.1 293T细胞包装和扩增反转录病毒519

基本方案1磷酸钙／DNA沉淀瞬时转染Phoenix反转录包装细胞519

备选方案1水疱性口炎病毒G蛋白的假型反转录病毒521

辅助方案1水疱性口炎病毒G蛋白假型反转录病毒的浓缩和低温储存521

辅助方案2 Phoenix细胞的培养522

基本方案2感染贴壁细胞523

备选方案2贴壁细胞快速（spin）感染（见基本方案2）523

备选方案3悬浮细胞的快速（spin）感染524

单元14.2免疫球蛋白融合蛋白的构建524

基本方案1免疫球蛋白融合蛋白的构建524

基本方案2免疫球蛋白融合基因分析526

单元14.3单链抗体的噬菌体展示技术529

基本方案1全套单链抗体噬菌体载体的构建532

基本方案2 scFv展示噬菌体在抗原包被板上的亲和筛选537

备选方案 链霉亲和素包被的磁珠富集筛选生物素化抗原结合的scFv展示噬菌体540

基本方案3 ELISA鉴定抗原结合的scFv展示噬菌体541

辅助方案1辅助噬菌体冻存液的配制543

辅助方案2指纹图谱和PCR检测克隆的正确性和多样性544

辅助方案3蛋白质的生物素化（NHS-SS-生物素）545

辅助方案4利用生物素-蛋白连接酶使蛋白生物素化545

单元14.4整体培养中同型转换重排的 PCR检测546

基本方案1通过转换接头的直接PCR546

辅助方案 通过PCR和随机引物标记法制备5′Sμ探针550

基本方案2消化-环化PCR550

单元14.5 PCR检测细胞因子mRNA的表达553

基本方案 定量IL-2 mRNA表达水平553

单元14.6 PCR检测人T细胞受体基因的表达556

基本方案PCR检测人T细胞受体基因的表达556

备选方案PCR定量检测TCR可变序列转录产物559

辅助方案1重排V-D-J区测序560

辅助方案2 cDNA合成562

单元14.7 PCR检测小鼠T细胞受体表达563

基本方案1 PCR分析小鼠TCR基因表达563

基本方案2 PCR检测小鼠TCR可变区的频率567

基本方案3对小鼠可变区转录物进行PCR定量567

基本方案4序列分析V（D）J区的接头多样性570

辅助方案cDNA合成用于小鼠TCR基因表达的PCR分析571

单元14.8 TCR库的抗原谱／免疫扫描技术分析572

基本方案1人和小鼠TCR受体库多样性的免疫扫描技术分析574

备选方案 利用［32P］ dCTP进行免疫扫描分析580

基本方案2链接区引物进行高特异的分光光度分析581

基本方案 3 TCR基因扩增产物的快速高通量测序582

单元14.9多探针核糖核酸酶保护试验同时测定mRNA表达586

基本方案 多探针核糖核酸酶保护试验586

辅助方案1构建一个核糖探针模板590

辅助方案2凝胶电泳和结果的可视化592

单元14.10端粒长度和端粒酶活性的分析593

基本方案1 Southern杂交检测传统凝胶电泳中末端端粒DNA限制性片段（TRF）的端粒长度593

备选方案1尼龙膜上的Southern杂交594

辅助方案1端粒或其他寡聚核苷酸末端标记595

基本方案2用脉冲电场凝胶电泳法测量端粒595

基本方案3荧光原位杂交597

基本方案4 Q FISH599

辅助方案2从分裂的淋巴细胞中制备分裂中期染色体601

基本方案5端粒酶活性的测定601

备选方案2非放射性的TRAP分析方法1：荧光染料（SYBR I）标记604

备选方案3非放射性的TRAP分析方法2：荧光染料（TAMRA-TS）标记604

第十五章 免疫分子与受体工程学606

单元15.1用MHC-Ig二聚体检测抗原特异性T细胞607

基本方案 构建MHC I-Ig 二聚体607

辅助方案1测定MHC-Ig融合蛋白浓度610

辅助方案2 J558L转染细胞大规模培养及上清的浓缩611

辅助方案3用5-碘-4-羟基-3-硝基酚乙酰-琼脂糖凝胶层析法纯化MHC-Ig二聚体612

辅助方案4制备5-碘-4-羟基-3-硝基酚乙酰-琼脂糖凝胶613

辅助方案5通过被动交换法为MHC-Ig嵌合蛋白负载多肽614

辅助方案6碱洗脱法负载多肽614

辅助方案7温和酸性条件下负载多肽615

辅助方案8流式细胞分析抗原特异性T细胞615

单元15.2用MHC肽四聚体显现抗原特异性T细胞616

基本方案1制备带BirA底物标签的MHC I类分子亚单位的包含体619

基本方案2 MHCI类分子肽复合物的重新折叠622

辅助方案1用ELISA测定MHC623

辅助方案2用分子大小排阻层析法进行超滤和纯化以浓缩折叠蛋白624

基本方案3用酶进行生物素化、纯化及生物素化效率的分析625

基本方案4用链亲和素使生物素化的单体形成多聚体628

基本方案5用标记的MHCI类分子四聚体通过流式细胞分析含特异性T细胞受体的细胞629

附录1 试剂与溶液631

附录2 实验用小鼠、大鼠和仓鼠701

附录2A 常用小鼠和大鼠品系701

附录2B 饲养704

附录2C 处理和捕捉706

基本方案1小鼠的处理和捕捉707

基本方案2大鼠的处理和捕捉707

基本方案3仓鼠的处理和捕捉708

备选方案 啮齿类动物捕捉器708

附录2D 麻醉709

基本方案1小鼠、大鼠和仓鼠的注射麻醉710

基本方案2用甲氧氟烷吸入法麻醉小鼠、大鼠和仓鼠711

附录2E 腹腔注射712

基本方案1小鼠、大鼠和仓鼠的肌肉注射712

基本方案2小鼠、大鼠和仓鼠的皮内注射713

基本方案3小鼠、大鼠和仓鼠的皮下注射713

基本方案4小鼠的静脉注射714

基本方案5小鼠、大鼠和仓鼠的腹膜内注射715

基本方案6小鼠足垫注射715

基本方案7小鼠胸腺内注射715

附录2F 血液收集716

基本方案1小鼠和大鼠的眼眶或眼血管丛取血717

基本方案2小鼠和大鼠的尾静脉微量采血管取血717

备选方案 从小鼠和大鼠的尾静脉以离心管取血718

基本方案3小鼠腋窝丛取血718

附录2G 安乐死719

基本方案1二氧化碳窒息719

基本方案2过量戊巴比妥注射719

备选方案1麻醉下放血720

备选方案2小鼠颈椎脱臼720

附录2H 淋巴器官和胸腺的摘除720

基本方案1小鼠淋巴器官的摘除720

基本方案2脾切除术722

备选方案 脾半切除术723

基本方案3新生鼠胸腺摘除724

基本方案4成年鼠的胸腺摘除术725

辅助方案 胸腺吸入套管的制备727

附录3 免疫学常用细胞实验技术729

附录3A 细胞生长的检测729

基本方案1血细胞计数板计数细胞729

基本方案2库尔特粒度仪计数细胞729

附录3B 细胞冻存730

基本方案1细胞株或杂交瘤的冻存730

基本方案2细胞株或杂交瘤细胞的复苏730

附录3C 台盼蓝拒染试验检测细胞活力731

基本方案731

附录3D 瑞氏-吉姆萨和非特异性酯酶染色732

基本方案1瑞氏-吉姆萨染色通常用于淋巴细胞形态的研究732

基本方案2非特异性酯酶染色733

附录3E 3 H TdR的掺入733

基本方案733

附录3F 判断并处理细胞培养中的支原体污染734

基本方案1检测可能存在的支原体污染734

基本方案2用BM-cyclin处理污染的细胞735

备选方案 用环丙沙星处理支原体污染的细胞736

附录3G 人外周血单个核细胞的分离736

基本方案 静脉穿刺采集外周血736

备选方案 淋巴细胞去除法取血737

附录4 试剂和设备的供应商738

参考文献785

索引797